形貌改变的人脐静脉内皮细胞通过外泌体中microRNA对THP-1炎症反应调节的研究

发布时间：2020-08-03 15:24

【摘要】：动脉粥样硬化(atherosclerosis,AS)是影响人类健康和生活质量的最严重的心血管疾病。As病理过程全程均有炎症反应的参与,并且涉及血管细胞,包括内皮细胞(endothelial cells,Ecs)和平滑肌细胞(smooth muscle cells,SMCs)等。已有的研究发现,内皮细胞(EC)来源的抗炎microRNAs可通过外泌体传递给单核细胞,抑制单核细胞的激活,进而影响血管炎症。目前,针对动脉粥样硬化等血管疾病的治疗方法中,血管组织工程是比较有发展前景的一种。对于工程血管材料,大量的研究和报道都集中在改良血管材料的化学组成或者添加不同的生长因子或药物等方面,而最新的研究表明,材料的物理性质对细胞行为的调控有非常重要的作用,我们的前期研究已经表明,细胞的形态可以受到材料的表面微观形貌的调控,甚至材料表面的微观形貌可以影响干细胞的定向分化。但是目前利用材料的物理特性影响内皮细胞调控炎症的作用尚未有报道。本课题的假设是,生物材料表面特定的微观形貌可以调节血管ECs与免疫细胞之间的交流,达到抑制炎症反应的目的。为了验证我们的假设,本课题设计了如下的研究体系:(1)我们使用一种常用的人工血管材料,聚二甲基硅氧烷(Polydimethylsiloxane,PDMS),制备了具有平行微槽(microgrooves,G)结构细胞培养基底,以没有凹槽的平滑PDMS材料(flat,F)作为对照。(2)利用人脐静脉内皮细胞(human umbilical vein endothelial cell,HUVEC)来体外模拟动脉的EC。(3)用脂多糖(lipopolysaccharide,LPS)活化的THP-1细胞株代表AS早期硬化斑块周围的炎症细胞,与HUVEC共培养,研究两者之间的调控关系。利用上述研究体系,我们研究了平行微槽结构的PDMS是否可以影响HUVEC外泌体分泌和基因的表达,进一步,HUVEC的这些改变是否可通过外泌体传递到脂多糖LPS活化的THP-1,进而影响THP-1的炎症反应。我的研究结果分为以下几个部分:(1)初步研究结果表明,当PDMS膜的凹槽结构为10?m宽,3?m深,10?m间距时,在其表面培养的HUVEC细胞形态发生显著变化,与光滑表面的多角形不同,被拉长成长梭形,且沿凹槽方向平行规整排列。microRNA表达量分析显示很多microRNA水平受到影响,尤其是炎症相关的microRNAs,如miR-10a、miR-21、miR-146a、miR-181b等,表达都显著上调(P0.001),而且这些microRNA对应的靶基因表达都受到抑制(P0.05)。(2)进一步的研究发现,随着HUVEC细胞内microRNAs的上调,与光滑表面相比,形态被微槽改变的HUVEC可分泌更多外泌体(P0.05)。与此同时,我们对HUVEC中上调的miR-10a、miR-21、miR-146a、miR-181b等抗炎microRNA在外泌体中的水平进行了分析,发现外泌体中携带的miR-10a水平显著上升(P0.01)。(3)为进一步研究外泌体miR-10a上升的生物学意义,在LPS活化的THP-1与HUVEC共培养后,发现与形貌改变的HUVEC共培养的THP-1中miR-10a的表达也显著上升(P0.05),相应的,其靶基因MAP3K7表达下调(P0.01)。激活的THP-1分泌的炎症细胞因子白介素-6(Interlukin-6,IL-6),白介素-1?(Interlukin-1?,IL-1?)以及肿瘤坏死因子?(Tumor necrosis factor-?,TNF-?)的表达均显著下降(P0.001),说明其炎症反应受到了显著的抑制。同时,由于形貌改变的HUVEC所表达的粘附因子(VCAM-1、ICAM-1、E-selectin)和趋化因子(MCP-1)均发生显著下调(P0.05),在黏附实验中发现THP-1的粘附减少。THP-1中,免疫调节基因如转换生长因子(Transforming Growth Factor,TGF-?1),白介素-10(Interlukin-10,IL-10)以及甘露糖受体(mannose receptor,MRC1)表达都有不同程度上调,提示在THP-1向巨噬细胞转化的过程中,形貌改变的HUVEC还可能调节THP-1的极化,有使其向M2型分化的趋势。以上结果说明,形貌改变的HUVEC确实可以通过旁分泌途径,通过抑炎microRNAs抑制THP-1的炎症反应。(4)为了进一步排除共培养体系中THP-1可能分泌的外泌体以及其它细胞外蛋白因子的反作用,我们还采用了转上清体系进行了上述结论的验证,即将HUVEC培养上清,加到THP-1中进行培养,发现结果和共培养体系完全一致,即THP-1中miR-10a的表达显著上升(P0.05)。在这些结果的基础上,为进一步验证HUVEC上清液中对THP-1发生作用的主要因素是外泌体,在转上清体系中,预先加入外泌体抑制剂抑制HUVEC外泌体的分泌,FACS结果表明外泌体数量显著下降(P0.05),并且外泌体中miR-10a表达水平都有大幅度降低(P0.001),THP-1中miR-10a水平也相应显著下降(P0.001),表明HUVEC抑制THP-1的功能的旁分泌途径中,外泌体起了重要的作用。综上,我们将生物材料的表面微观结构与血管炎症联系起来,探索了具有表面微观结构的PDMS膜对于HUVEC及其外泌体的影响,以及探索这个影响如何通过外泌体传递到下游靶细胞THP-1,调节其炎症反应。外泌体作用的加入为AS的致病过程提供了理论上的补充,并且为生物医用材料的设计优化提供新的思路。
【学位授予单位】：上海交通大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2018
【分类号】：R543.5;R318.08
【图文】：

血液动力学,血小板粘附,单核细胞,粘附

子的表达和渗透具有重要的影响[9]。如图1-1在血管平流层，内皮细胞沿着血流的方向致平行生长并且有完整的细胞间连接，而湍流处内皮细胞随机方向生长，并处于较高的激活状态。相对于血液平流层，湍流处的内皮渗透性较高，细胞粘附因子增加，导致血流白细胞如单核细胞向血管内皮组织的粘附。旦粘附，单核细胞能通过受损的内皮连接处进入血管壁和内皮下组织，这破坏激活内皮组织导致血小板粘附。血小板粘附促使生物材料表面血栓形成，导致血管的堵塞[10]。在回流处

形貌,PDMS膜,凹槽,模板

43]。根据以上研究，实验中我们将具有表面平行凹槽结构PDMS基质（如图1-2所示用于制作PDMS膜的硅片模板）模拟血流对于内皮细胞的形貌和功能的改变，验证相对于平滑材料上生长的无序的内皮细胞，形态被拉长的细胞对炎症反应的影响。图 1-2 用于制作 PDMS 膜模板具有的光滑和凹槽结构的表面Figure 1 Flat and grooved surface of templates used to fabricate PDMS membranes（图片来源：Gasiorowski J Z, Liliensiek S J, Russell P, et al.Alterations in Gene Expression ofHuman Vascular Endothelial Cells Associated with Nanotopographic Cues[J]. Biomaterials, 2010,31(34):8882.）1.3 炎症在动脉粥样硬化中作用动脉粥样硬化是心血管疾病的大诱因，而炎症是动脉粥样硬化的大发病机制[44-47]。人类对动脉粥样硬化(atherosclerosis, AS)的研究已逾百年，众多发病假

条纹,进程,血管壁,单核细胞

本特征[45, 46]。病变发展过程中，如图1-3从脂质条纹到纤维斑块再到粥样斑块，乃至不稳定斑块的生成、破裂和血栓形成，始终都有各种炎症细胞和大量炎症介质参与，AS的各种改变可认为是慢性炎症的不同阶段，各种细胞反应本质上与炎症过程相似，同属于机体对损伤的种反应[47, 48]。动脉粥样硬化斑块具有许多炎症反应激活的特征，包括单核细胞进入血管壁并被激活，内皮细胞激活，细胞因子和趋化因子等促炎介质上调[49-52]。其中单核细胞进入血管壁已被视为AS发生的关键步骤

【相似文献】