基于仿生肺芯片技术的香烟烟雾提取物诱导支气管上皮细胞恶性转变的机制研究

发布时间：2020-08-06 14:26

【摘要】：背景:20世纪90年代以来,研究对象的微型化成为自然科学和工程技术的发展趋势之一,微流控芯片技术应运而生。微流控芯片的主要技术特征是在微米尺度空间内操控流体进行常规物理、化学和生物实验,因此又称为“芯片实验室(Lab on a chip)”。仿生微流体细胞培养装置,也称为“芯片上的器官”。具体到仿生肺芯片中,通过对肺部气-液交界的动态微环境的模拟,已经在急性肺损伤、哮喘和肺癌等疾病的研究中取得了一些突破。慢性阻塞性肺疾病(COPD)的发生与长期的有毒气溶胶暴露相关。其基本病理特征之一是由气道炎症引起的、不完全可逆的气流受限。香烟烟雾暴露是COPD和肺癌的危险因素。COPD的组织学改变主要是气道上皮的重构和组织纤维化,炎症细胞向黏膜、黏膜下层浸润,导致供血不足和上皮细胞死亡;另一方面,肺癌的典型病理改变为细胞不受控增殖和新血管网络形成。这两种病理转变之间的机制引起了广泛关注。由于肺部理化环境复杂,存在着气-液交界和多种细胞的相互作用,现有的体外细胞模型未能尽量模拟这种特征,实验动物模型则存在着耗时长、成功率低的缺点。器官芯片的出现为解决上述问题提供了条件。在本实验中,我们应用微流控芯片技术,构建了一种能够模拟肺部气-液交界的动态微环境的仿生肺芯片模型,完成了支气管上皮和血管内皮的气液双相动态共培养。信号转导与转录激活因子-3(STAT3)与炎症、细胞增殖、肿瘤的血管生成和转移有关。最近的研究表明,香烟烟雾和其他多种致癌因子、放射线、病毒、和炎症因子能够激活STAT3,调控c-fos、c-myc、cyclin-D1等基因的表达,导致肿瘤发生。STAT3的激活也和化疗和放疗抵抗相关,在肿瘤性疾病的各个阶段中均能起到一定作用。本研究中我们提出假设:香烟烟雾进入肺单元后,对上皮造成直接损伤,导致可溶性物质溶于血液,形成肺单元局部的慢性炎症微环境,破坏肺气-血屏障,诱导细胞发生上皮-间充质转变,最终导致恶性转变的发生。为了验证这个假说,我们在仿生肺芯片模型上完成了支气管上皮细胞和血管内皮细胞的气液双相动态共培养,并进行了持续香烟烟雾暴露实验,以明确STAT3的作用。方法:1.仿生肺芯片的设计和加工(1)采用具有良好的生物相容性和透光性的聚二甲基硅氧烷作为芯片基材,采用SU-8光刻法进行芯片的加工。(2)芯片设计为多层结构,内部结构尺寸模拟真实的肺单元平均体积,通过规律抽吸模拟呼吸运动对肺单元的拉伸。(3)采用鼠尾胶原对芯片内部进行修饰后完成细胞的气液双相共培养,采用活细胞示踪法验证细胞的生存率。2.在肺芯片模型上进行香烟烟雾暴露(1)CCK8法检测支气管上皮细胞BEAS2B和人脐静脉内皮细胞HUVEC对香烟烟雾提取物的敏感性。(2)ELISA法检测肺芯片上香烟烟雾提取物诱导的炎症水平。(3)RT-PCR法检测持续香烟烟雾暴露后支气管上皮细胞和血管内皮细胞中顶端连接复合体的mRNA水平。(4)蛋白印迹法检测两种细胞中STAT3和相关蛋白表达水平的变化。(5)CCK8法检测支气管上皮细胞BEAS2B和人脐静脉内皮细胞HUVEC对小分子药物HJC0152的敏感性。(6)流式细胞术检测HJC0152对持续香烟烟雾暴露诱导的支气管上皮细胞周期的影响。(7)双荧光素酶报告基因实验检测HJC0152对持续香烟烟雾诱导的细胞STAT3转录激活的影响(8)蛋白印迹方法STAT3通路的相关蛋白的表达水平。结果:1.仿生肺芯片模型可以用于完成动态气液双相共培养,芯片上的细胞生长状态良好。2.在仿生肺芯片模型中进行香烟烟雾暴露,能够诱导动态共培养体系发生炎症因子表达。其中炎症因子IL-6的水平明显高于静态培养中的IL-6水平。IL-6/STAT3信号通路在香烟烟雾引起的肺部炎症反应中起到重要作用。3.持续的香烟烟雾暴露会引起肺气-血屏障的破坏;支气管上皮细胞与血管内皮细胞的顶端连接复合体均发生了降解。烟雾暴露会引起上皮-间充质转变。4.香烟烟雾暴露引起支气管肺上皮细胞中c-myc、cyclin D1和p-ERK的表达升高。磷酸化STAT3水平的升高与细胞增殖活跃有相关性。5.小分子通路抑制剂HJC0152能够抑制STAT3的转录活性,降低STAT3磷酸化程度,进而减少c-myc、cyclin D1的表达。经持续的香烟烟雾刺激后支气管上皮细胞BEAS2B细胞周期中G1期减少,S期细胞比例增多;HJC0152可以部分逆转这种趋势。结论:1、应用微流控技术构建的仿生肺芯片模型能够模拟肺部的气液交界微环境,对上皮细胞和血管内皮细胞进行动态的共培养。2、在仿生肺芯片模型上,IL-6/STAT3通路在香烟烟雾引起肺部炎症因子表达中发挥作用,持续的香烟烟雾暴露引起肺气-血屏障的破坏和上皮间充质转化。3、STAT3的激活会引起原癌基因c-myc和cyclin D1表达上调,在芯片模型中再次证实了STAT3是香烟烟雾引起的炎症发生恶性转变的关键作用位点。4、通路阻滞剂HJC0152可能在香烟烟雾引起的肺部炎症发生恶性转变的过程中起到抑制作用。综上所述,我们的研究证明了微流控仿生芯片在模拟肺部复杂微环境与香烟烟雾暴露之间的相互作用方面具有优势。STAT3可能是炎癌转化的调控因子之一,但其具体的调控机制还需要进一步深入研究。同时,STAT3通路阻滞剂HJC0152也有可能在香烟烟雾相关的肺炎和恶性转变中发挥作用,在临床上具有的潜在应用价值,为肺癌的研究提供了新的思路。
【学位授予单位】：吉林大学
【学位级别】：博士
【学位授予年份】：2019
【分类号】：R318
【图文】：

微流控,模型,芯片

在芯片上加工出微米级尺寸的通道（10-100μM）可以对单细胞（10-20μM）进行操纵和分析。通过对芯片进行空间结构的设计，将样品引入微流通道后，经由施加电场力、静压力等手段，能够在特定的位置实现对某一类别细胞的捕获。这种单细胞捕获芯片已经广泛地应用于体外即时诊断（point-of-caretesting，POCT），比如转移性实体瘤的外周循环肿瘤细胞（circulating tumor cells，CTCs）检测[14]。而在细胞培养芯片中进行结构设计，可以量化细胞的迁移侵袭能力[15]和黏附力[16]。在此基础之上设计出的三维细胞共培养芯片，可以对肿瘤微环境中细胞与细胞外基质的相互作用进行深入研究[17]。相比于传统的静态体外细胞模型和体内模型，微流控芯片细胞模型也具有一定的优势（图 1.1）。

哈佛,芯片,芯片结构,相关实验

之上还建立了集成度更高的多器官功能芯片或人体芯片（multi-organ-on-chip，body-on-chip），用于预测器官或系统间的相互作用[8, 9]。器官芯片设计和加工的基本原则之一是对体内关键作用单元的微环境进行最大程度的模拟。具体到仿生肺芯片中，其首要条件就是再现肺-毛细血管界面结构和周期性的呼吸运动[22]。常用的器官芯片多采用具有良好弹性的 PDMS 进行加工，这种芯片基材具有高透光性，可以使用高分辨率的显微镜观察肺部疾病过程中的多种细胞之间的相互作用。通常肺芯片被设计成为两层培养腔结构，中间用多孔薄膜分隔开。通过对与培养腔平行的空腔规律抽吸，可以使上下两层培养腔中的多孔薄膜规律伸缩，借此来模拟正常肺部的呼吸运动。到目前为止在肺芯片上已经建立了小气道疾病、肺水肿和血栓形成、哮喘和外源性急性肺损伤等疾病的模型[23]。

示意图,微流控,化疗药物,乳腺

图 1.2 微流控装置研究癌相关性成纤维细胞诱导的细胞转移和侵袭示意图肿瘤球（Tumorsphere）也被集成到肿瘤侵袭的微流控模型中。Choi 等人开发了一种仿生微系统，再现了乳腺导管原位癌的三维组织结构。芯片模型由嵌入到三维支架中共培养的 MCF10 细胞、人乳腺导管上皮细胞和成纤维细胞组成。在模仿腺体自然结构的微流控体系内，对这几种细胞进行共培养。该研究中，研究者将微流控装置作为药物筛选平台，在体系内引入用紫杉醇后发现，即便出现了一定程度的肿瘤细胞的耐药现象，紫杉醇的使用仍然能够阻止肿瘤细胞对周围基质的侵犯[30]。

【相似文献】