基于水凝胶封装的干细胞玻璃化保存和3D培养

发布时间：2020-08-11 12:31

【摘要】：干细胞在生物医学工程中的应用越来越广泛,应对日渐增大的干细胞需求,低温保存干细胞显得尤为重要。传统的慢速冷冻会造成细胞不可避免的损伤,常规的玻璃化保存细胞往往需要高浓度的渗透性低温保护剂,使样品在冷冻过程中完全玻璃化,降复温过程中没有冰晶形成,这样才能确保细胞冷冻复温后有较高的存活率。人们通常为了减少玻璃化保存过程中胞内冰的形成一方面加高渗透性低温保护剂的浓度,另外一方面减小玻璃化保存样品的体积,增加降温和复温过程中的温度变化速率。高浓度(≈8M)、有毒的低温保护剂往往会对细胞造成不可逆的损伤,减小冷冻样品体积往往使冷冻过程变得复杂,增加操作人员的工作量,细胞在冷冻过程的损失率增加。针对目前玻璃化保存存在的问题,本文在损伤机理的研究中,通过冷热台实现5℃/min、10℃/min和15℃/min三种不同的降温速率,再通过显微镜上摄像机记录下细胞在不同降温速率下体积变化,得到实验数据通过数学公式拟合得到间充质干细胞在冷冻过程中细胞膜对水输运两个重要参数,渗透性系数Lpg和水输运的活化能ELp,并用它设计更好的冷冻方案,从机理上了解冷冻过程中减少细胞的溶液损伤和胞内冰损伤。同时采用20℃/min、30℃/min和60℃/min三种不同的降温速率测试间充质干细胞在冷冻过程中胞内冰形成的概率,找到合适降温速率,减少冷冻过程中胞内冰对细胞的损伤。本文在玻璃化保存辅助材料上,采用水凝胶来抑制玻璃化冷冻和复温过程中胞内冰的形成,以往水凝胶封装玻璃化保存要求完全玻璃化,因此要求微胶囊直径足够小(直径250μm)和低温保护剂浓度足够高(≈8M),本文采用核壳结构的大体积水凝胶微胶囊(直径500μm)装载猪的脂肪干细胞部分玻璃化保存(微胶囊外边有冰晶形成,微胶囊内部由于水凝胶对冰晶抑制作用,无冰晶形成,因此,避免了胞内冰对细胞的损伤),大大提高了封装效率,本研究中的大体积微胶囊可以实现对大体积(十几到几百毫升的样品)细胞悬浮液(在细胞治疗和移植中使用频繁)的快速封装。并使用超低浓度的低温保护剂(≈2 M渗透性低温保护剂加0.5M非渗透性低温保护剂),直接投入到液氮中进行冷冻,冷冻复苏后得到的细胞存活率较高(代替完全玻璃化或者带有可见冰的部分玻璃化)。使用不同组份四组的低温保护剂条件下,水凝胶封装后能够大大提高细胞冷冻后的存活率(四种不同配方的低温保护剂封装后冷冻保存得到的细胞存活率依次为:24%到73%,25%到71%,25%到63%和21%到56%)。本研究表明水凝胶微胶囊在细胞的冷冻和复温过程中能够有效地抑制冰晶的形成和传播。大体积的微胶囊在干细胞的治疗方面存在着很大的潜在的应用价值。本文同时对微胶囊的产生方法上进行改进,与传统的微液滴是通过油相和水相或者水相和油相两相剪切形成的相比,本研究采用三相全水生物相容性较好的溶剂快速生成海藻酸钠微胶囊的方法,有效的保护细胞活性。本文中的方法相比传统水-水相生成微胶囊的方法,能够灵活对微胶囊的良径、壳核相对厚度进行调节,使用的外围溶液是与细胞相容性较好的水溶性溶液,这使得在交联生成水凝胶微胶囊的过程中细胞或其他生物样品的活性不会受到损伤。封装猪的脂肪干细胞,用于3D培养,由于整个封装和交联过程中,细胞都处于生物相容性较好的溶液中,细胞受到损伤较小,细胞的生长状况良好,细胞在第七天已经生长成团并且没有出现明显的细胞死亡。本文还在大体积微胶囊封装保存干细胞的基础上,把最外层溶液用氯化钙溶液替换油相,生成具有壳核结构的微纤维,进一步提高封装效率,同时微纤维的形状与生物的血管、肌腱和神经比较类似,对更进一步3D培养仿生学有重要的意义。采用微纤维状水凝胶封装猪的脂肪干细胞(pADSCs)悬浮液,且用纱布包裹后直接投入液氮中,实现超低浓度低温保护剂条件下的玻璃化保存。尤其在1M渗透性(0.5M丙二醇和0.5乙二醇)低温保护剂条件下玻璃化保存后存活率超过70%,本方法外层连续相使用了 CaCl2溶液代替以往的油相,避免了从油相中把微纤维分离出来的操作。该研究用微纤维封装细胞,封装效率远远大于微胶囊封装细胞。因为微纤维和微胶囊相比,易于盛放,不需要特殊的冷冻容器盛放,可以直接投入液氮或者液氮蒸汽中玻璃化保存,且直接投放液氮或者液氮蒸汽中,降温速率要远大于用容器盛放的样品的降温速率。
【学位授予单位】：中国科学技术大学
【学位级别】：博士
【学位授予年份】：2018
【分类号】：R318.52
【图文】：

示意图,降温速率,示意图,细胞

的两因素假说这是一个根据冷冻过程中溶液的结冰量，并对渗透过程进行定逡逑量分析后建立起来的方程。因为各种细胞体积不同，他们细胞膜对水的渗透量也逡逑不同，所以在低温保存过程中不同的细胞有着不同的最佳降温速率。如下图１．１逡逑中ａ图所示：如果降温速率太慢，细胞外溶液相对于细胞内溶液优先接触外边冷逡逑源而慢慢结冰。因此，细胞外溶液浓度会不断升高，细胞内外形成渗透压差，细逡逑胞内水分将不断渗出，细胞处于高浓度的溶液环境下，导致细胞强烈收缩，如果逡逑细胞过度收缩会造成细胞骨架和一些蛋白质结构遭到破坏，即细胞长时间处于高逡逑浓度的溶液中会受到损伤［５＿８］，这就是造成细胞损伤的第一个因素即溶液损伤；逡逑同时，如果冷冻速度过快，细胞内溶液来不及往细胞外渗透，因过冷而结冰，这逡逑就是造成细胞低温损伤的第二个因素，被称为胞内冰损伤。那么在这两个因素的逡逑共同制约下

玻璃化保存,结构示意图

图１．２封装玻璃化保存结构示意图［３６〗逡逑究现状逡逑细胞在添加、去除保护剂和冷冻过程中的跨膜水输运逡逑由于技术条件的限制，细胞保存绝大数条件下需要添加去除低常用的渗透性低温保护剂（ＣＰＡ）—二甲亚砜（ＤＭＳＯ）、丙二醇（例。通常情况下，细胞膜对渗透性低温保护剂的渗透效率要小于效率。所以，当这些低温保护剂溶液加入到细胞悬浮液中，细胞增大，细胞内部渗透压短时间内基本保持不变，细胞内外就会产胞内水溶液会透过细胞膜流出细胞，细胞体积会随之收缩，随着低温保护剂不断向细胞内部渗透，细胞内外渗透压最终达到平衡，复到接近于添加保护剂前的正常体积，此时细胞处在等渗溶液环

示意图,成核机制,表面催化,体积

和Ｐ．邋Ｍａｚｕｒ等人，均相成核和异相成核是过冷溶液产生冰晶的两个成核方式。其逡逑中，异相成核的冰晶是由杂质粒子、瑕疵表面和晶体上的分子团聚集形成的；均逡逑相成核的冰晶则是由纯水中产生的随机热波动形成的。如下图１．３所示，Ｍ．邋Ｔｏｎｅｒ逡逑等人认为均相成核和异相成核同时存在，诱发冰晶形成的核子来自细胞内部，即逡逑通常所说的体积诱发成核机制（Ｖｏｌｕｍｅ邋Ｃａｔａｌｙｅｄ邋Ｎｕｃｌｅａｔｉｏｎ，ＶＣＮ），这是因为逡逑细胞内一些微小粒子在低温条件下，可以促进细胞内水结晶。此外，在细胞内结逡逑晶前，细胞外水溶液先结晶，细胞外的冰晶可能会对细胞产生机械力和化学作用逡逑导致细胞膜结构发生变化，间接为细胞内冰晶形成提供场所，就是表面诱发机理逡逑（Ｓｕｒｆａｓｅ邋Ｃａｔａｌｙｅｄ邋Ｎｕｃｌｅａｔｉｏｎ，ＳＣＮ）。Ｐ．Ｍａｚｕｒ等人认为细胞膜外冰晶通过细胞逡逑膜上的微孔进入细胞，这些微小冰晶的介入，为细胞内部冰晶形成提供了必要的逡逑场合

【相似文献】