基于生物信息学分析阿尔茨海默病患者外周血和脑组织糖酵解信号通路相关因子的表达变化及其临床意义

发布时间：2020-08-11 15:16

【摘要】：目的:阿尔茨海默病(Alzheimer's Disease,AD)是一种慢性神经退行性疾病,其主要临床表现为记忆力逐渐减退、认知功能发生障碍、行为异常和社交障碍等,一般发现患病时多已进展至中至重度症状。AD患者的主要病理学特征是β-淀粉样蛋白(Aβ)聚集成老年斑,细胞内Tau蛋白异常聚集形成神经元纤维缠结(NFT)和神经元死亡。2018年全球AD患者约为5000万人,而照护AD患者的成本总计为1万亿美元,预计至2050年AD患者将达到1.52亿人,照护AD患者的成本将增加至2万亿美元,为患者家庭与社会带来沉重负担。AD的发病机制至今尚不清楚。目前主流的AD发病机制有β-淀粉样蛋白(amyloidβ-protein,Aβ)异常沉积、Tau蛋白过度磷酸化及胆碱能假说等。目前尚无有效的AD干预方法,而其一旦发病即不可逆转,因此,早期检测出AD并进行干预,可使发病往后延缓5-10年,可大大减轻家庭负担和医疗系统压力。目前,AD的诊断主要是通过简易智能状态检查量表(MMSE)、头部CT、冠状位MRI、18F-脱氧核糖葡萄糖正电子扫描(18FDG-PET)、脑电图(EEG)及Aβ生物标志物等。但每种方法皆存在缺点,因此,寻求一种有效、准确、推广性好的早期AD检测方法具有重要意义,是迫切需要解决的问题。AD的病理发生部位在脑部,大脑对高能量的需求使其对葡萄糖可用性和代谢相关功能的缺陷变化敏感,大脑利用全身约25%的葡萄糖,其中大部分用于通过糖酵解和线粒体氧化磷酸化转导能量以支持突触传递,通过保持与神经元中葡萄糖利用相关的能量稳态和代谢过程的保护性疗法来达到治疗AD实际上是可行并且具有相当的潜力。由于AD的病理生理特殊性,临床难以得到脑组织物样品,因此,随着生物信息学的兴起,通过GEO数据库,比对脑组织及外周血的基因表达差异,将为寻找AD生物标志物提供有力支持。目前尚无在AD能量代谢方面的生物信息学研究。本研究以糖酵解作为切入点,通过生物信息学对AD进行多样本、多组织、新方法及新角度的分析,以GEO数据库为基础,通过生物信息学预测和计算机技术进行数据挖掘,为AD治疗和AD生物标志物寻找提供理论基础和依据。方法:1,通过GEO数据库搜索关键词“阿尔茨海默病”,从中筛选出符合纳入条件的AD微阵列数据集。2,通过ScanGEO R语言在线工具对以选择的AD微阵列数据集进行分析,选择“糖酵解信号通路”并分析糖酵解信号通路里所有基因的表达情况,通过R语言ANOVA分析后自动保存P0.05具有统计学意义的结果,然后筛选在多个微阵列数据集中表达趋势一致的基因进行下一步分析。3,通过STRING在线工具对前面获得的基因进行蛋白-蛋白相互作用网络分析,查找出与目标基因有关联的基因。4,通过Metascape在线工具,对目标基因及其相关基因进行功能与信号通路富集分析,分析这些基因参与的信号通路与主要负责的生物功能。5,对以上结果进行系统性分析并考察目标基因在AD的作用与影响,并评估其临床价值。结果:1,通过GEO数据库筛选出符合纳入条件的三个AD相关的微阵列数据集,分别为GSE36980、GSE1297和GSE4226。其中,GSE36980、GSE129为脑组织来源的基因芯片,而GSE4226为外周血来源的基因芯片。GSE36980总样本量最多,共包含79个样本,并包含了额皮质、颞叶皮质和海马区三个不同脑区。GSE1297的样本来自海马区,共包含31个海马样本,并对AD患者进行了轻度、中度和重度三个不同程度的分组。GSE4226包含28个外周血样本。2,通过ScanGEO对上述3个基因微阵列数据进行分析获得60个差异基因,进而进一步针对糖酵解信号通路筛选得到葡萄糖-6-磷酸异构酶(GPI)、丙酮酸脱氢酶E1成分亚单位α(PDHA1)与葡萄糖-6-磷酸酶2(G6PC2)三个差异表达基因。3,GPI、PDHA1基因表达随AD的病情加重而显著下调,而G6PC2则与之相反:(1)GSE1297芯片提示与健康老年人海马区相比,轻度AD患者PDHA1的表达呈现出下调趋势,但未见统计学差异(P0.05),中度AD患者PDHA1表达显著下调(P0.01),而重度AD患者PDHA1表达则进一步显著降低(P0.0001),总体PDHA1的表达量随着AD病情的加重而呈现递减趋势。对于GPI的表达来讲,呈现与PDHA1相同的趋势,其中在重度AD患者中显著降低(P0.05)。对于G6PC2的基因表达则呈现出与PDHA1及GPI相反的趋势,随着AD病情的加重,其表达呈现增加的趋势,其中在重度AD患者海马区其表达显著高于健康老年人(P0.01)。(2)与GSE1297的海马区差异基因相似,GSE36980芯片同样提示了在海马区PDHA1及GPI的表达降低(P0.05),而G6PC2则在AD女性患者群体中存在显著上调(P0.05),提示对于女性AD群体G6PC2具有预测意义。进一步通过比对不同脑区组织差异基因发现,与其他脑区相比,海马区的PDHA1(P0.05)、GPI(P0.0001)显著低于其他脑区,而G6PC2则显著高于其他脑区(P0.001),提示海马作为与学习记忆最密切相关的脑区,对于糖酵解基因的变化最为敏感。(3)在外周血来源的GSE4226芯片中,与健康老年人相比,只有GPI在AD患者外周血中出现了与脑组织相同的下调趋势,且在男性AD患者中存在显著下调(P0.05),在女性AD患者中虽然显示了下降趋势,但无显著统计学意义(P=0.07),提示外周血中GPI的显著下调与脑内呈现相同趋势,可作为AD生物标志物进行早期诊断,尤其对于男性AD的诊断具有重要意义。4,蛋白-蛋白相互作用网络分析发现BCKDHA、DLST、PDK3、CS、PFKM、DLAT、OGDH、PDHB、GAPDHS、PGM2、DBT、TPI1、G6PD、DLD、PGM1、PDHA2、PGK1、GAPDH、PDHX、ENO1等共20个与PDHA1、GPI和G6PC2高度相关的基因。进一步进行GOKEGG功能发现,GPI、PDHA1和G6PC2与HIF-1缺氧诱导因子信号通路存在直接相关性。通过热图可视化分析发现,PDHA1、GPI和G6PC2都显示出糖酵解/糖异生通路方面功能。其中PDHA1和G6PC2还显示出参与HIF-1信号通路方面的功能。GPI与G6PC2主要参与磷酸戊糖途径、葡萄糖6-磷酸代谢过程和葡萄糖稳态这些与葡萄糖利用相关的功能调控。结论:1,PDHA1与GPI在AD患者脑内显著下调,而G6PC2显著上调,与AD病情密切相关,且脑组织中的海马区对三者的改变最为敏感,可联合作为早期诊断AD的生物标志物组合。其中,GPI在外周血中与脑组织表达一致,可用作外周血预测AD的生物标志物。2,PDHA1、GPI及G6PC2主要参与HIF-1信号通路、磷酸戊糖途径、葡萄糖6-磷酸代谢过程和葡萄糖稳态的功能调控,为深入挖掘糖酵解在AD发生发展中的机制提供了客观依据与支持。
【学位授予单位】：中国医科大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2019
【分类号】：Q811.4;R749.16
【图文】：

海马,重度,中度,样本

图 1. PDHA1（A）、GPI（B）和 G6PC2（C）在不同程度 AD 时表达量的变化GSE1297 一共包含 31 个海马样本，其中 9 例为健康老年人，22 例为 AD 患者（轻度 AD，n=7；中度 AD，n=8，重度 AD，n=7。*P < 0.05 ， ** P < 0.01 ， *** P < 0.001 ， ****P < 0.0001，与健康老年人相比。

芯片,情况,患者,颞叶皮质

图 2. GSE36980 芯片中 PDHA1 基因的差异表达情况在 AD 不同脑区的表达量变化（A），AD 患者的海马区与正常健康老年人的对比（B），AD 患者的海马区与 AD 患者其他脑区的对比（C）。GSE36980 中包含一共 79 个样本，其中：33 个额皮质样本（18 例健康，15 例 AD）; 29 个颞叶皮质标本（19 例健康，10 例 AD

芯片,情况,患者,颞叶皮质

图 3. GSE36980 芯片中 GPI 基因的差异表达情况GPI 在 AD 不同脑区的表达量变化（A），AD 患者的海马区与正常健康老年人的对比（B）。AD 患者的海马区与 AD 患者其他脑区的对比（C）。GSE36980 中包含一共 79 个样本，其中：33 个额皮质样本（18 例健康，15 例 AD）; 29 个颞叶皮质标本（19 例健康，

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