仿生磷脂酰胆碱聚合物材料与C-反应蛋白作用机理研究

发布时间：2020-08-12 04:10

【摘要】：C-反应蛋白(C-reactive protein,CRP)在机体的先天免疫系统中发挥着重要的保护作用,但是它的某些生理学功能如促炎、细胞因子刺激、促动脉粥样硬化和促血栓等却存在一定的争议。研究表明,商业化CRP中含有的内毒素、NaN_3等污染物是这些争议产生的主要原因。因此,为了解决这些争议以验证CRP的生理学功能和拓宽其临床应用范围,如何获得高纯度无污染、结构和功能完整的人源CRP是一个亟待解决的问题。磷脂酰胆碱(phosphorylcholine,PC)因其优异的生物相容性而被广泛应用于生物医学领域,同时作为CRP的关键配体而备受关注。但是,在CRP的纯化中,传统的PC材料存在制备繁琐、机械强度差、传质速率慢和非特异性吸附高等缺点,难以满足高效快速纯化复杂体系中CRP的迫切需求。因此,本论文拟在前期工作的基础上,研制具有不同交联剂、间隔臂长度/数量及配体排布方式的仿生磷脂酰胆碱聚合物材料,研究它们对CRP吸附性能的影响,探讨它们与CRP之间的作用机理差异,为后期新型CRP亲和纯化材料和方法的开发提供科学依据。论文的主要内容和结论如下:第一章,系统介绍了CRP的基本情况,包括其临床应用、结构与功能等。重点讨论了CRP与PC的结合机制及其生理学功能争议,并对CRP的纯化进行了简要概括。此外,对仿生磷脂酰胆碱聚合物材料的应用进行了详细综述,主要涉及其生物相容性和CRP的人工受体两个方面。在此基础上,提出了本论文的研究思路与创新点。第二章,制备了具有不同交联剂、间隔臂长度/数量及配体排布方式的仿生磷脂酰胆碱聚合物材料,以研究它们对CRP吸附性能(特异选择性、吸附容量、亲和力和加标人血清样品中CRP的纯化)的影响。首先对这些材料的表面电荷、配体密度、比表面积和孔径大小等进行了表征。结果表明,所制备的仿生磷脂酰胆碱聚合物材料不仅适于生物大分子的分离分析,而且还具有抗蛋白质非特异性吸附的潜质。第三章,研究了交联剂对CRP吸附性能的影响。结果发现,三种不同交联剂组成的仿生磷脂酰胆碱聚合物材料对CRP不仅具有良好的特异选择性,而且对其吸附容量和亲和力相近,表明交联剂对CRP的特异选择性、吸附容量和亲和力没有明显的影响。但是,只有Poly(MPC-co-MBA)和Poly(MPC-co-PDA)才能有效纯化加标人血清样品中的CRP,且两者的纯化效果明显优于Poly(MPC-co-EDMA),表明交联剂极性的增加带来的仿生磷脂酰胆碱聚合物材料亲水性的增强能有效避免蛋白质的非特异性吸附。第四章,研究了间隔臂长度/数量对CRP吸附性能的影响。结果发现,三种不同间隔臂长度/数量的仿生磷脂酰胆碱聚合物材料对CRP均具有良好的特异选择性,但是它们会影响聚合物材料对CRP的吸附容量和亲和力。研究表明,适当的间隔臂长度和数量能够减少CRP与PC结合过程中的空间位阻作用,增加CRP与PC配体之间的有效结合几率,从而提高聚合物材料对CRP的吸附容量。但是,过高的吸附容量可能会增强CRP之间的空间排斥作用,导致CRP-PC复合物的稳定性变差,亲和力减弱。然而,只有长链Poly(MDPC-co-EDMA)才能有效纯化加标人血清样品中的CRP,且其纯化效果明显优于短链Poly(MPC-co-EDMA),表明适当长度的间隔臂能够有效避免杂蛋白在聚合物材料表面的非特异性吸附;而双链Poly(MDSPC-co-EDMA)的纯化效果略优于短链Poly(MPC-co-EDMA),但明显不如长链Poly(MDPC-co-EDMA),表明双链Poly(MDSPC-co-EDMA)中的另外一条疏水性烷基链对复杂人血清样品中的蛋白质有一定的非特异性吸附作用。第五章,研究了配体排布方式对CRP吸附性能的影响。结果发现,与Poly(MPC-co-MBA)相比,当PC配体仅排布有磷酸Poly(EGMP-co-MBA),或胆碱Poly(METAM-co-MBA),或磷酸与胆碱等摩尔横向排布Poly(E1M1-co-MBA)时对CRP均无吸附作用,表明PC配体结构的完整性及其官能团的固有空间排布方式是保证CRP与之结合的先决条件。然而,当PC配体位于整个分子的中间充当连接臂时所制备的仿生磷脂酰胆碱聚合物材料Poly(MMPC)不仅能够特异选择性地吸附CRP,而且拥有一个较大的吸附容量,只是亲和力略低于Poly(MPC-co-MBA)中末端游离的PC配体,这可能与两种聚合物中PC配体与CRP的结合行为不同有关。此外,Poly(MMPC)因其更强的亲水性而能有效地抗蛋白质非特异性吸附,从而展现出了优异的加标人血清样品中CRP纯化的效果,其纯度高达98%,非常具有开发应用的前景。第六章,对全文进行系统性总结,并对仿生磷脂酰胆碱聚合物材料及CRP作用机理的后续研究工作进行了展望。
【学位授予单位】：暨南大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2018
【分类号】：R318.08
【图文】：

CRP的水平与分级

暴露面

图 1-3: CRP 的结构与暴露面Fig. 1-3. Structure and exposed faces of CRP CRP 与 PC 的结合作用RP 通过与受损细胞膜上的两性离子极性头部磷脂酰胆碱（phosphorylch合而激活补体系统[28]。如图 1-4a 所示，CRP 的每个原体都能发生这种的与 PC 的特异性结合作用。PC 的结合位点由一个疏水性的口袋和两个图 1-4b），其中疏水性口袋由 64 位亮氨酸、66 位苯丙氨酸和 76 位苏氨酸，两个 Ca2+通过与来自一级结构不同部分的氨基酸的侧链和主链羰基相互RP 相结合[62]。RP-PC 复合物的晶体结构（图 1-4c）表明 66 位苯丙氨酸和 81 位谷氨酸是 PC 特异性结合的两个关键氨基酸。PC 的磷酸酯基团（P=O 和 P-O-）直

模型图,构象,蛋白C,模型

炎症部位的 CRP 主要以 pCRP*的形式存在，并负责激活补体系统，进而加剧炎症反应。图1-6 为 pCRP 向 pCRP*的构象重排过程及 pCRP*与补体蛋白 C1q 的作用模型示意图。

【参考文献】