纳米氧化铈促进基于软骨内成骨的大段骨缺损修复的研究

发布时间：2020-08-15 21:07

【摘要】：研究背景:骨缺损是指骨的结构完整性被破坏,主要由于创伤、感染、肿瘤、骨髓炎手术清创、骨肿瘤切除导致,是临床常见的疾病之一。1986年SchmitzJP等提出临界骨缺损的概念,将骨缺损长度达到长骨直径的1.5倍作为骨缺损的临界值,当骨缺损达到或者超过临界值时骨缺损便无法自然愈合。据此诸多学者将大于长骨直径1.5倍的骨缺损称为大段骨缺损。大段骨缺损会引起运动功能丧失并严重影响患者生活质量,其修复一直是临床上的难题。传统临床治疗大段骨缺损主要依赖于骨移植,但因移植骨来源有限、供体-受体免疫排斥反应等缺点极大的限制了该方法在临床上的广泛应用。目前骨组织工程学的飞速发展,为治疗大段骨缺损带来了新的方法,也成为研究的热点。骨组织工程技术不仅可以修复大段骨缺损,且可以按照损伤区形状大量制备,克服了自体、异体骨移植所导致的供区损伤,移植区免疫排斥和致病性等缺点,是公认用于大段骨缺损修复的理想方法。骨组织工程构建组织工程骨进行体内骨缺损修复主要方式有两种:膜内成骨和软骨内成骨。最近的研究证实,与膜内成骨相比,软骨内成骨因其有较为丰富的血供,能更好的进行大段骨缺损的修复。软骨内成骨发育过程中,肥大软骨细胞产生富含X型胶原的无血管软骨基质、分泌基质金属蛋白酶13(MMP13)和血管内皮生长因子(VEGF),从而介导矿化基质的形成和血管入侵。伴随血管侵入的成骨细胞、破骨细胞和造血前体细胞介导软骨模板的再吸收和血管化骨的形成。因此肥大软骨细胞的调节是软骨内成骨的关键环节,软骨细胞肥大化不足会阻碍软骨内成骨过程中的血管入侵和基质矿化,延迟骨的形成。保证间充质干细胞的充足肥大化是研究软骨内成骨为基础的骨再生的重点,深入发掘其具体分子机制,将可以为临床治疗大段骨缺损提供新的理论基础和治疗方案。最近几十年来,纳米材料因其独特的仿生特征和生物学特性,已成为组织再生领域的研究热点。越来越多的研究表明,部分纳米材料可以通过调节干细胞增殖和分化在骨组织工程中发挥关键作用。在这些纳米材料中,氧化铈纳米颗粒(Ceria nanoparticles,CNPs)因其晶格表面共存三价与四价铈离子(Ce~(3+)/Ce~(4+)),低还原电位使二者可以相互转换,从而赋予了CNPs独特的再生潜能及自由基清除能力,已受到人们极大关注,被广泛应用于纳米生物学和再生医学。目前已有文献报道,CNPs在骨组织中富集,通过其抗氧化特性增强间充质干细胞(Mesenchymal stem cells,MSCs)的粘附与增殖,并进一步刺激MSCs的旁分泌促进内皮祖细胞在骨形成过程中的血管化。但CNPs对MSCs多向分化潜能的影响及其在骨修复中的作用尚不清楚,揭示CNPs调节MSCs多向分化的具体机制,将可以为基于CNPs为生物材料的骨组织工程提供理论基础,对临床治疗大段骨缺损具有重要意义。研究目的:本课题以研究CNPs对骨髓间充质干细胞(Bone mesenchymal stem cells,BMSCs)多向分化潜能的影响为基础,探索基于CNPs为生物界面材料的骨组织工程在大段骨缺损修复中的作用及机制。材料与方法:1.通过微乳液法合成CNPs,并以碳酸盐化合物阿仑膦酸(Alendronate,AL)作为锚定分子,通过多齿配位的方式稳定的结合在CNPs表面,其氨基末端可以有效结合羧基化的PEG链,从而对CNPs表面进行PEG修饰。2.体外探究PEG修饰后的CNPs分别对BMSCs成骨、成软骨、成脂分化的具体影响。(1)通过透射电子显微镜(Transmission Electron Microscope,TEM)观察CNPs在BMSCs中的定位;(2)CCK-8检测CNPs对细胞增殖的影响;(3)通过采用甲苯胺蓝、番红O(Safranin O)、免疫组化染色等不同方法检测CNPs对BMSCs成软骨分化及肥大分化进程的影响,并于诱导后7天、14天分别收取细胞团样品,采用qRT-PCR及Western blot方法检测成软骨相关基因Sox9、COMP、Col2a1的表达情况,于诱导后21天、28天分别收取细胞团样品,通过qRT-PCR及Western blot方法检测软骨肥大化相关基因Runx2、MMP13、Col10a1的表达情况;(4)采用碱性磷酸酶(Alkaline phosphatase,ALP)和茜素红染色分别检测成骨分化中碱性磷酸酶及钙结节的表达情况,并于成骨诱导后7天、14天、21天分别收取细胞样品,通过qRT-PCR及Western blot检测成骨相关基因Runx2、Osterix2、Col1a1、ALP的表达情况;(5)采用油红(Oil red O)染色检测CNPs对BMSCs成脂分化中脂滴的形成情况,分别于诱导后10天、21天收取细胞样品,通过qRT-PCR及Western blot检测成脂相关基因PPARγ、C/EBPα、C/EBPβ的表达情况。3.通过动物模型,研究PEG修饰后的CNPs作为组织工程骨的界面修饰材料对大段骨缺损修复的效果。(1)将CNPs作为界面修饰材料复合在脱细胞骨基质(Acellular bone matrix,ACBM)上构建组织工程骨支架,将细胞种植在支架上,通过扫描电子显微镜(Scanning electron microscope,SEM)观察细胞的生长状态,激光共聚焦显微镜(Laser scanning confocal microscope,LSCM)观察细胞凋亡情况及中性红染色检测细胞的增殖情况,从而评估构建的组织工程骨支架的生物相容性,为体内模型植入奠定前期实验基础;(2)建立裸鼠皮下异位成骨模型,将构建的组织工程骨支架分别于植入皮下6周、12周后取材,进行组织切片染色,观察成骨方式及检测成骨相关基因的表达;(3)FVB/N小鼠建立股骨中段约3 mm的大段骨缺损模型,将含有CNPs的组织工程骨植入小鼠体内12周后取材,microCT观察骨缺损修复情况,组织切片染色观察新骨生成方式,并检测成骨相关基因的表达。4.探究PEG修饰后的CNPs促进基于软骨内成骨的大段骨缺损修复的机制。我们前期研究表明CNPs可以促进DHX15的表达,而文献表明DHX15可以激活p38 MAPK信号通路,且p38 MAPK信号通路在BMSCs软骨及肥大分化过程中发挥关键作用。在本部分研究中,拟采用qRT-PCR及Western blot检测CNPs诱导BMSCs成软骨分化及肥大化过程中DHX15表达的变化;在软骨分化和肥大化分化过程中使用DHX15干扰质粒,qRT-PCR,免疫荧光,Western blot检测DHX15的作用;使用干扰质粒后加入CNPs,qRT-PCR、免疫荧光、Western blot检测CNPs能否通过影响DHX15的表达调控BMSCs的软骨分化及肥大化,继而调控软骨内成骨进程。研究结果:1.我们通过微乳液法稳定合成CNPs,且粒径平均大小维持在3 nm,PEG修饰后CNPs能更好的分散在溶剂中。2.BMSCs软骨分化实验表明,CNPs能促进软骨相关基因Sox9、COMP、Col2a1及肥大相关基因Runx2、MMP13、Col10a1的表达;BMSCs成骨分化实验表明,CNPs抑制钙结节和碱性磷酸酶的形成及成骨相关基因Runx2、Osterix2、Col1a1的表达;BMSCs成脂分化实验表明,CNPs能抑制脂滴的形成及成脂相关基因PPARγ、C/EBPα、C/EBPβ的表达。3.裸鼠皮下异位成骨实验表明,CNPs能促进血管形成和新骨生成。4.小鼠原位股骨中段大段骨缺损修复实验表明,CNPs能增强基于软骨内成骨的临界尺寸的骨缺损再生。5.DHX15能激活p38 MAPK的磷酸化,干扰DHX15将抑制BMSCs的软骨分化及肥大化,CNPs能促进DHX15的表达并部分回复下调的基因表达。结论:1.CNPs可以促进BMSCs的软骨分化及肥大化,抑制BMSCs的成骨分化和成脂分化。2.CNPs能通过软骨内成骨的方式促进裸鼠皮下异位成骨及原位大段骨缺损修复。3.DHX15是BMSCs软骨分化及肥大化过程中的调控因子,且DHX15通过激活p38MAPK磷酸化发挥调控作用。4.CNPs通过激活DHX15/p38 MAPK信号通路调控BMSCs的软骨分化和肥大化,以促进软骨内成骨进程。
【学位授予单位】：中国人民解放军陆军军医大学
【学位级别】：博士
【学位授予年份】：2019
【分类号】：R318.08

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