适用于活体皮层成像的光透明颅窗研究
发布时间：2020-09-02 12:20
在过去的20年内,荧光标记技术与双光子显微技术的发展为神经科学的研究提供了重要的研究工具,使在体跟踪与操纵神经元、胶质细胞和微脉管系统成为可能,从而更有效地理解大脑。然而皮层上方颅骨的混浊特性严重制约了光学成像对皮层结构与功能的观察。为此,研究人员通过将颅骨完全或者部分去除的方式,建立了多种颅窗,但都存在一定的弊端与不足。组织光透明通过降低组织的散射,为克服浑浊颅骨对光学成像的制约提供了全新的思路。但现有研究多局限于离体组织与器官,针对活体组织的光透明研究较少。本文的工作正是围绕活体颅骨光透明而展开的,旨在建立高效、安全、操作简便的光透明颅窗,实现细胞、亚细胞分辨水平的穿颅活体皮层成像。本文的主要内容如下:(1)颅骨光透明试剂的选型与方法的构建:基于颅骨特殊的分层结构及组分,以简便、高效、快速为原则,通过离体和在体实验对颅骨光透明试剂进行选型,最终确定颅骨光透明试剂由胶原蛋白酶、乙二胺四乙酸二钠和甘油组成;针对不同年龄的小鼠,确立适用于活体皮层成像的光透明颅窗的实施方案。(2)光透明颅窗实施活体皮层成像的性能评估:开展活体皮层成像实验,从有效性、重复性、与荧光蛋白/染料的兼容性等方面对光透明颅窗的性能评估。结果显示,实施颅骨光透明处理后,光学成像的信噪比、分辨率与成像深度得以极大地提高,获取了亚细胞分辨水平的皮层结构信息,实现了皮层250μm深度内神经元、胶质细胞和血管的高分辨重复成像。(3)光透明颅窗的安全性评估:光透明颅窗结合多种光学成像技术,观测皮层免疫细胞的短期与长期响应、皮层星形胶质细胞中胶质纤维酸性蛋白的表达、以及皮层血流分布或血管重构与再生,评估光透明颅窗的安全性。结果显示该颅窗既未激活皮层的小胶质细胞,也未引起皮层胶质纤维酸性蛋白表达的上调;既未改变皮层血流分布,也未引起软膜血管重构与再生,从而证明该颅窗的安全性。(4)光透明颅窗的初步应用:(1)激光损伤后皮层树突和小胶质细胞形态变化的动态观测;(2)脑梗塞后皮层树突和小胶质细胞形态变化的动态观测;(3)发育关键期皮层突触可塑性的动态观测。结果显示,激光损伤后,损伤区域树突形成串珠状结构,而损伤区域小胶质细胞的突起朝向损伤部位运动,这与文献结果一致;脑梗塞后,梗塞区域树突迅速形成串珠状结构,这与文献结果一致。梗塞区域小胶质细胞并没有迅速被激活,在梗塞后的24小时其形态和分布均发生剧烈变化,从而证实小胶质细胞的浸润时间窗为0 24小时之间;通过对第三周小鼠皮层突触可塑性的动态观测,发现关键期小鼠皮层树突棘和丝状伪足的能动性很高,其桶状皮层树突棘在1小时内的新生率和消亡率分别为3.20±0.36%和1.83±0.91%,并观察到丝状伪足转变成树突棘结构,这暗示了丝状伪足可能是树突棘的前体。综上所述,本文构建了一种适用于活体皮层成像的光透明颅窗,通过在颅骨表面涂抹光透明试剂来减小颅骨的散射,形成一个可观测皮层的视窗。与双光子成像相结合,实现对皮层神经元、胶质细胞和血管的高分辨活体成像研究。此颅窗具有高效、安全、可重复且操作简便等特点,既能实现对皮层细胞、亚细胞水平结构的跟踪观察,也可实现对皮层特定区域的靶向操纵。这种光透明颅窗有望为生理或疾病状态下皮层神经、血管的结构与功能性成像研究提供重要工具。
【学位单位】：华中科技大学
【学位级别】：博士
【学位年份】：2018
【中图分类】：R318
【部分图文】：
华 中 科 技 大 学 博 士 学 位 论 文样本，双光子使用的是平均功率很低的脉冲光。将脉冲激光与高数值孔径的物镜结合增大了光子密度，进而增加了双光子同时被荧光团吸收的可能性。双光子是非线性激发的过程，荧光团的吸收率与激发光功率的平方根成线性，对于聚焦的激光而言，只有焦平面的光子密度最高，在焦平面的上下光强随着距离的平方衰减，因此只有在接近衍射限制体积内的荧光团被激发[7,28,33]。与单光子成像相比，双光子局部激发不需要在探测器前加共焦针孔，具有三大优势：光漂白光毒性更小、成像深度更深、对比度更高。因此更适合于活体高分辨成像研究。
图 1.2 双光子活体成像的典型应用。（a）神经可塑性研究[12]；（b）小胶质细胞的结构与功能研究[52]；（c）毛细血管流速的研究[36]；（d）双光子活体钙成像的研究[58]；（e）光解笼锁的研究[60]（f）光遗传技术的研究[64]。Figure 1.2 The typical applications of two-photon imaging. (a) The neural plasticity[12]. (b) Thestructure and function of microglia[52]. (c) The velocity of blood flow[36]. (d) Calcium imaging[58]. (e)Photolysis[60]. (f) Optical genetic technology[64].下面以结构成像中突触连接的发育与可塑性研究为例，对其进行较为详细的介绍：在整个生命过程中都有突触的形成和消失，相关小组研究了在不同的发育阶段树突棘可塑性变化规律，研究结果表明树突棘的稳定性随年龄的增长而逐渐形成，新生小鼠出生后约两周内树突棘新生率大于消亡率，树突棘的数目逐渐增加，两周达到最大，这属于树突棘的发生过程，树突棘在发育阶段可塑性很高，在小鼠达到成年前树突棘消亡率逐渐高于生成率，树突棘总量明显下降，表现出树突棘的修剪在不同的脑区树突棘修剪发生的幅度和时程不同，到了成年趋于稳定，为信息的长
图 1.3 实施活体皮层成像的颅窗技术。（a）磨薄颅窗[12]；（b）开颅玻璃窗[11]；（c）基于磨薄手术的磨薄加固的颅窗[81]；（d）基于开颅手术并用生物相容的硅树脂替代玻片的颅窗[76]；（e）基于开颅手术和微型光学流体装置的颅窗[71]。Figure 1.3 Schematic view of current crainal windows for in vivo imaging. (a) The thinned-skullwindow[12]. (b) The open-skull glass window[11]. (c) The polished and reforced thinned skull window(PORTs)[81]. (d) The cranial window based on the craniotomy by using biocompatible silicone insteadof cover slide[76]. (e) The cranial window based on craniotomy and micro-optical fluid devices[71].1.2.3 其它颅窗2010 年研究人员发展了磨薄加固的颅窗技术（PORTs）[64,81,82]，它是通过将磨削手术和开颅手术两种技术结合在一起而实现的，首先将颅骨打磨至极薄（10 1μm），再在剩余的骨膜上覆盖玻片，这种方式结合了磨削手术和开颅手术这两种技术的特点，通过将颅骨磨薄而不是开颅，避免了由暴露硬脑膜引起的炎症反应和皮层损伤，同时用玻片覆盖剩余的骨组织可有效地阻止骨再生，因此在重复成像之前无需再次对同一位点进行反复磨削，实现了手术后无需在有其他干预的情况下在任
本文编号：2810587
【学位单位】：华中科技大学
【学位级别】：博士
【学位年份】：2018
【中图分类】：R318
【部分图文】：
华 中 科 技 大 学 博 士 学 位 论 文样本，双光子使用的是平均功率很低的脉冲光。将脉冲激光与高数值孔径的物镜结合增大了光子密度，进而增加了双光子同时被荧光团吸收的可能性。双光子是非线性激发的过程，荧光团的吸收率与激发光功率的平方根成线性，对于聚焦的激光而言，只有焦平面的光子密度最高，在焦平面的上下光强随着距离的平方衰减，因此只有在接近衍射限制体积内的荧光团被激发[7,28,33]。与单光子成像相比，双光子局部激发不需要在探测器前加共焦针孔，具有三大优势：光漂白光毒性更小、成像深度更深、对比度更高。因此更适合于活体高分辨成像研究。
图 1.2 双光子活体成像的典型应用。（a）神经可塑性研究[12]；（b）小胶质细胞的结构与功能研究[52]；（c）毛细血管流速的研究[36]；（d）双光子活体钙成像的研究[58]；（e）光解笼锁的研究[60]（f）光遗传技术的研究[64]。Figure 1.2 The typical applications of two-photon imaging. (a) The neural plasticity[12]. (b) Thestructure and function of microglia[52]. (c) The velocity of blood flow[36]. (d) Calcium imaging[58]. (e)Photolysis[60]. (f) Optical genetic technology[64].下面以结构成像中突触连接的发育与可塑性研究为例，对其进行较为详细的介绍：在整个生命过程中都有突触的形成和消失，相关小组研究了在不同的发育阶段树突棘可塑性变化规律，研究结果表明树突棘的稳定性随年龄的增长而逐渐形成，新生小鼠出生后约两周内树突棘新生率大于消亡率，树突棘的数目逐渐增加，两周达到最大，这属于树突棘的发生过程，树突棘在发育阶段可塑性很高，在小鼠达到成年前树突棘消亡率逐渐高于生成率，树突棘总量明显下降，表现出树突棘的修剪在不同的脑区树突棘修剪发生的幅度和时程不同，到了成年趋于稳定，为信息的长
图 1.3 实施活体皮层成像的颅窗技术。（a）磨薄颅窗[12]；（b）开颅玻璃窗[11]；（c）基于磨薄手术的磨薄加固的颅窗[81]；（d）基于开颅手术并用生物相容的硅树脂替代玻片的颅窗[76]；（e）基于开颅手术和微型光学流体装置的颅窗[71]。Figure 1.3 Schematic view of current crainal windows for in vivo imaging. (a) The thinned-skullwindow[12]. (b) The open-skull glass window[11]. (c) The polished and reforced thinned skull window(PORTs)[81]. (d) The cranial window based on the craniotomy by using biocompatible silicone insteadof cover slide[76]. (e) The cranial window based on craniotomy and micro-optical fluid devices[71].1.2.3 其它颅窗2010 年研究人员发展了磨薄加固的颅窗技术（PORTs）[64,81,82]，它是通过将磨削手术和开颅手术两种技术结合在一起而实现的，首先将颅骨打磨至极薄（10 1μm），再在剩余的骨膜上覆盖玻片，这种方式结合了磨削手术和开颅手术这两种技术的特点，通过将颅骨磨薄而不是开颅，避免了由暴露硬脑膜引起的炎症反应和皮层损伤，同时用玻片覆盖剩余的骨组织可有效地阻止骨再生，因此在重复成像之前无需再次对同一位点进行反复磨削，实现了手术后无需在有其他干预的情况下在任
【参考文献】
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1 张洋;颅骨光透明实现穿颅皮层血管与血流成像[D];华中科技大学;2014年
本文编号：2810587
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