带仿生血管网复合肌组织支架与体外组织工程化方法研究

发布时间：2020-09-15 09:36

　　肌肉移植是有效修复大面积肌肉缺损的手段,但由于可利用的肌肉来源有限,供区损伤较大,以及异体移植供体来源和免疫排斥等问题,使其应用受到限制。随着组织工程的发展,尤其是骨骼肌组织工程在肌肉组织再生和功能重建方面的进展,为解决骨骼肌组织缺损和功能丧失等问题带来了希望。本文构建了一种带血管网酶交联水凝胶与EVOH电纺基底膜叠加组装的复合肌组织工程支架,通过体外灌流-拉伸动态培养,实现了肌细胞定向排列和向肌小管体外分化的过程,为仿生血管网的参数优化提供理论参考和实验依据。本文主要工作及成果如下:首先,以仿生设计思路为指导,通过分形模型的理论计算,提出了一种多级多尺寸的仿生血管网结构。通过分布函数计算出该血管网的分形维数为2.99,证明设计模型符合体内微小血管的功能要求,形成结构与功能相适应的生物学概念。通过CFD流体分析,将血管网模型与DAVID体外模型灌流的压力-流速曲线进行对比,结果表明流速误差小于5%,证实流体分析方法的有效性。其次,研究仿生血管网的微制造工艺,通过SLA光固化成型法和翻模制造方法,制备TG酶交联水凝胶作为基质材料的仿生血管网。研究制造仿生血管网的成型精度、降解速度和生物相容性等性能,结果证明基质材料成型精度高,可以长时间维持微流道结构,在流体和重力等因素作用下,微流道截面形状逐渐由矩形转变成更接近体内实际结构的圆形,且细胞毒性低,生物相容性好。通过CFD流体分析,确定1ml/min的流速作为体外培养的灌流参数。第三,通过多细胞共培养技术,研究了酶交联水凝胶材料的生物相容性,证实肌细胞,内皮细胞和成纤维细胞共培养时,可以在基质材料内呈现良好的增殖趋势。在仿生血管网内种植HUVEC-GFP细胞,灌流培养后,通过对细胞进行细胞形态学和增值动力学检测,研究了血管网参数对内皮化的影响。结果证明,500μm内的仿生血管网中,血管直径越小对形成内皮化越为有利,而分叉角则对细胞的生长和代谢影响不大。第四,根据体内肌肉结构,设计了血管网-基质-筋膜层的叠加式复合肌组织工程支架。通过电纺技术制备EVOH纳米纤维膜,模拟体内筋膜层,并与带血管网水凝胶组装构建复合支架。研究了纳米纤维筋膜层的制备工艺参数和支架组装工艺,叠加式支架的灌流和力学性能,为体外动态培养提供了可拉伸的肌组织工程支架模型。同时还研究了筋膜层基底膜的生物相容性和抑菌作用等生物性能,证实该支架具有良好的生物相容性,同时具有广谱抗菌作用,为多因素体外动态培养提供了有利条件。第五,设计带密封腔室的生物反应器,搭建了体外灌流-拉伸动态培养平台。该平台提供了一种密封腔室的力学拉伸试验系统,并且准确控制软组织的拉伸量。此外,该系统能够实现分别对腔室和血管网进行灌流,模拟体内血液的流动和营养供给,为细胞的增殖,延长和分化提供研究基础。第六,在体外灌流-拉伸动态培养系统上,对带血管网的肌组织工程支架进行体外动态培养。提出了一种肌组织工程体外动态培养评价方法,研究了血管网结构参数对肌细胞定向排列和分化的影响。结果证明仿生血管网能有效促进肌细胞实现定向排列和分化,并且证实了本文仿生血管网内培养液的渗透距离大约为300μm。
【学位单位】：西安科技大学
【学位级别】：博士
【学位年份】：2018
【中图分类】：R318.08
【部分图文】：

示意图,肌组织,支架,打印方法

西安科技大学博士学位论文2图1.1 肌肉组织工程[7]1.2 国内外研究现状1.2.1 肌组织工程支架制备方法的研究现状近年来，3D 打印技术广泛应用在肌组织工程的研究领域，该方法可成型复杂功能型支架/细胞外基质（ECM）[20]。目前主要使用的方法有以下三种，选择性激光烧结(SLS)，光固化成型(SLA)，以及熔合沉积法(FDM)和压力挤出成型（PBE），如图 1.2 所示[21]。(a)SLS 打印法 (b)SLA 打印法 (c) FDM 和 PBE 打印法图1.2 肌肉组织工程3D打印方法示意图[21]新加坡南洋理工大学 Yeong 等人使用 SLS 成型方法，烧结出 PCL 聚合物的多孔肌肉支架

示意图,打印方法,肌小管,示意图

(a)SLS 打印法 (b)SLA 打印法 (c) FDM 和 PBE 打印法图1.2 肌肉组织工程3D打印方法示意图[21]新加坡南洋理工大学 Yeong 等人使用 SLS 成型方法，烧结出 PCL 聚合物的多孔肌肉支架，封装 C2C12 成肌细胞经诱导后形成大面积肌小管，证明该方法成型的结构，可保证培养液充分浸入，为内部细胞提供充足的氧气和营养[22]。如图 1.3 所示。(a)CAD 模型 (b)SEM 图像 (c)培养 6d 的 C2C12 分化为肌小管图1.3 SLS法打印骨骼肌支架[22]支架单元构建细胞片层细胞培养肌肉组织的产生细胞提取体内种植构建定向排列肌小管构建肌纤维复合支架4mm 100μm 100μm100μm

翻模,水凝胶,支架,特异性基因

图1.4 SLA法翻模制备PEG水凝胶支架[23]技大学 Pati 等人将小鼠肌细胞 C2C12 封装到生物墨水中，多孔脱细胞支架，培养 4d 后检测到心脏特异性基因(Myh6数量不断增加直到 14d[24]，如图 1.5 所示。

【参考文献】