矿化胶原对小鼠巨噬细胞RAW264.7极化影响的实验研究

发布时间：2020-09-16 08:26

　　目的:随着组织工程和再生医学的发展,越来越多的学者认识到生物材料能够用于调控炎症反应,理解生物材料与机体免疫系统之间的相互作用变得非常重要。其中巨噬细胞在该过程中发挥了关键性作用,其M1/M2(经典活化巨噬细胞/替代活化巨噬细胞)极化状态和炎性分泌功能会影响组织的预后。矿化胶原(Mineralized Collagen,MC)由羟基磷灰石(Hydroxyapatite,HA)和胶原(Collagen,COL)两种成分构成,与天然骨组织具有相同的化学组成及微观结构,具有优于羟基磷灰石的骨诱导性。然而,生物材料植入体内后最早期的状态是手术创伤及炎症反应,其修复过程并非仅与成骨细胞相关。目前矿化胶原植入体内后对免疫系统的影响尚不明确。因此有必要就矿化胶原植入体内对巨噬细胞极化及炎症功能的影响进行深入研究,全面分析其植入体内后的生物反应,更加全面的诠释矿化胶原的优异性能,为其今后在临床的应用奠定基础。研究方法:将RAW264.7小鼠巨噬细胞分别接种于培养玻片(空白对照组,LPS+IFN-γ诱导组,IL-4诱导组)、MC、HA和COL表面,在相应的时间点:1.应用免疫荧光方法观察细胞形态,用NIS-Elements D软件计算细胞铺展面积。2.应用免疫荧光方法检测巨噬细胞膜表面M1/M2特异性标志分子CD86/CD206的表达。3.应用ELISA方法检测巨噬细胞培养上清液中炎症相关细胞因子TNF-α和IL-10的分泌水平。结果:1.MC、HA和COL表面巨噬细胞形态均与对照组不同且三组之间也有差异。LPS+IFN-γ诱导组细胞铺展面积(522.964±113.0528μm~2)最大,显著高于其他5组(P0.0001);HA表面细胞铺展面积(415.695±98.681μm~2)是MC表面细胞铺展面积(242.004±31.759μm~2)的1.7倍,二者之间具有显著差异(P0.0001)。2.MC表面增加了CD206+巨噬细胞(M2)的表达;HA表面则表达更多的CD86+巨噬细胞(M1);COL在3d时生成的CD86+/CD206+共表达型巨噬细胞最多。3.MC增加了抑炎细胞因子IL-10的分泌,HA增加了促炎细胞因子TNF-α的分泌。结论:矿化胶原(MC)能够诱导巨噬细胞RAW264.7向M2型极化,在刺激机体炎症反应方面性能优于羟基磷灰石(HA)和胶原(COL),更有利于组织重建。
【学位单位】：中国医科大学
【学位级别】：硕士
【学位年份】：2018
【中图分类】：R318.08
【部分图文】：

功能图,巨噬细胞,功能

重要的、能够调控机体疾病进展和损伤后组织重建的调节器受到广泛关注用好像一个闸门调控着宿主免疫反应，维持机体内环境的稳态[10]。巨噬细种多功能细胞，在不同刺激因素作用下，会表现出不同的极化表型[9]。根可以分为两种极化类型：经典活化的 M1 型和替代活化的 M2 型。M1 型可由 IFN-γ和 LPS、TNF-α诱导产生，主要分泌一些促炎因子，在炎症反挥宿主免疫功能，同时导致机体正常组织的炎症损伤，常见的标记分S、CD86、TNF-α和 IL-6 等[11-13]。M2 型巨噬细胞可由 IL-4、IL-10 和 IL生，具有抗炎作用，通过分泌抗炎细胞因子下调免疫应答，促进伤口愈合建，在炎症反应后期发挥重要作用，常见的标记分子为 CD206、CD163等[11,13-15]。经典活化 M1 型和替代活化 M2 型巨噬细胞具有很强的动态性和受体内微环境中不同刺激因素的影响可以相互转化[16]。组织内的巨噬细胞到 M2 的连续表达谱，根据两种极化分型所占比例的不同可以提示组织修复、重建方向与预后结果[13]（图 1）。

细胞形态,巨噬细胞

中国医科大学硕士学位论文3 结果1 细胞形态RAW264.7 细胞分别接种在 MC、HA、COL 表面，LPS + IFN-γ 、IL-4 诱导作阳性对照组，不加任何刺激作为空白对照组，1d 后荧光染色观察黏附细胞的形（图 1.1）。从图 1.1 中我们可以观察到空白对照组细胞形态为圆形、纺锤形；S + IFN-γ 诱导组细胞完全铺展，形似变形虫，伸出许多板状伪足；IL-4 诱导组伸长；在 MC 表面，黏附细胞呈圆形，而且铺展面积也较小；在 HA表面，黏细胞形态不规则，大部分细胞伸出伪足，与 LPS + IFN-γ 诱导组的黏附细胞形态；在 COL 表面，黏附细胞形态各异，部分伸出伪足，部分为纺锤形或圆形。

铺展面积,贴壁细胞

【参考文献】