骨髓胚胎样干细胞向起搏细胞的诱导分化

发布时间：2020-09-24 16:58

　　病窦综合征、房室传导阻滞等是常见的心律失常疾患,严重危害人类健康。目前的治疗方法主要是植入电子起搏器。但是电子起搏器仍然有很多缺点无法克服,如囊袋血肿、感染等。生物心脏起搏器成为心律失常领域研究的热点。鉴于基因转染构建生物心脏起搏器技术的缺陷,细胞移植和组织工程化起搏、传导组织移植,可能是生物心脏起搏器应用于临床的惟一或重要途径。无论是细胞移植、还是组织工程化起搏、传导组织移植构建生物心脏起搏器,首先必须解决的是种子细胞问题。近年来研究发现,骨髓中存在一种体积较小、干性较强的胚胎样干细胞(Embryonic-like stem cells,ELSCs),由于该细胞可来源自体、无免疫排斥反应;具有胚胎干细胞的特性,易于诱导分化;应当是诱导分化为心起搏细胞的理想种子细胞之一,但目前未见其向心起搏细胞诱导分化的报道。ELSCs分离与培养,是向心起搏细胞诱导分化的物质基础,目前已报道分离培养ELSCs的方法,存在方法复杂、仪器设备昂贵、技术要求高、多用血清等特点,拟获得活性好、纯度高的ELSCs,有必要积极开展ELSCs分离与培养方法的研究。干细胞的诱导分化,是获得移植细胞和构建组织工程化组织、器官种子细胞的主要手段。鉴于基因编辑的诱导分化有较多未研究清楚的问题,非基因干涉的诱导分化方法,值得进行深入探讨。基于以上观点,本课题拟以ELSC为种子细胞;采用全骨髓细胞培养、明胶包被及无血清培养的方法,分离培养ELSC;化学和微环境模拟的方法诱导ELSC向起搏细胞分化,以探讨体外诱导ELSC分化为心起搏细胞的可能性,为生物起搏器的临床应用,奠定实验基础。第一部分ELSCs的分离、培养和鉴定研究目的研究ELSC的分离纯化和鉴定方法、生物学特性,获取可以用于诱导起搏细胞的种子细胞,并与MSC对比其干性强弱,确定其幼稚程度,探讨其来源。材料和方法采用全骨髓培养、明胶包被、无血清培养的方法,培养1月大SD大鼠骨髓细胞,5天后进行第一次传代,以后每2天传代一次。观察其形态结构,免疫荧光、流式细胞术和免疫印迹法检测干性标志物的表达,ELISA检测端粒酶含量,并与MSC相比较。结果获得的ELSC呈长梭形,体积小且形态均一。分离得到的MSC体积较大,有长梭形、三角形、圆形等多种形态,传代后细胞变得扁平,呈现老化特征。免疫荧光、免疫印迹法检测,ELSCs与MSCs相比,ELSCs的SSEA-4、OCT-4、Sox-2、Nanog等干性基因高表达,端粒酶含量高。结论通过全骨髓细胞培养、明胶包被和无血清培养,获得了干性较强、具有胚胎样干细胞形态结构的ELSC,ELSC可能是存在于骨髓中的间充质干细胞中的一种较幼稚、原始,具有胚胎干细胞特性的亚群。第二部分ELSC向心起搏细胞的诱导分化研究目的诱导ELSC向心起搏细胞分化,探讨非基因干涉的方法诱导ELSC向心起搏细胞分化的可能性。材料和方法分别采用5-氮杂胞苷、窦房结上清液、窦房结裂解液、窦房结共培养和联合诱导分化的方法,诱导ELSC向起搏细胞分化。观测诱导分化后细胞的形态,免疫荧光、RT-PCR、免疫印迹法等检测cTnT、HCN4、Cx45等相关基因、蛋白的表达。结果ELSC向起搏细胞的诱导分化,3周后免疫荧光显示,窦房结细胞培养上清液诱导组表达cTnT和Cx45,5-aza组和上清液组HCN4为弱阳性表达;免疫印迹法显示,HCN4和Cx45的表达,联合诱导共培养裂解液上清液5-aza;PCR显示,联合诱导组起搏相关基因的表达高于其他组;流式细胞检测HCN4的表达,从5-aza诱导组的4%、共培养组的15%、联合诱导组提高到25%左右。但各组诱导分化后的细胞,均未出现自发搏动的细胞。结论单一方法难以将ELSC诱导分化为起搏细胞,联合诱导分化的方法,虽然未出现自发搏动的细胞,但是具有了早期心细胞的特点,高表达起搏细胞的HCN4和CX45,是最有可能将ELSC诱导分化为起搏细胞的方法。
【学位单位】：中国人民解放军海军军医大学
【学位级别】：硕士
【学位年份】：2019
【中图分类】：R54;R318.08
【部分图文】：

生长曲线,标尺,形态,对数生长期

图1-1 ELSC和MSC形态（标尺100μm）A：ELSC原代第三天（×100）B：MSC原代第三天（×100）C：ELSC原代第五天（×100）D：MSC原代第八天（×100）E：第五代ELSC（×100） F：第五代MSC（×200）ELSC与MSC的生长曲线可以看出，ELSC从第2天就进入对数生长期，第6天后进入平对数生长期较ELSC晚，且在第7天才进入平台期。

生长曲线,生长曲线,标志物,荧光显示

图1-2 ELSC和MSC的生长曲线（三）ELSC与MSC的免疫荧光检测疫荧光显示ELSC表达CD73、CD90、CD105，而CD34、CD45（造血干、Laminin a-2（成纤维细胞标志物）均为阴性。干性标志物方面ELSC-4、Oct-4、Nanog、Sox2，而SSEA-1弱表达。

标志物,白细胞分化抗原,表面标志,造血干细胞

图1-3 ELSC的免疫荧光检测结果（P3）A：SSEA-1+; B：SSEA-4+; C: Nanog+; D：Oct-4+;E：Sox2+； F：CD105+； G:CD73+； H：CD90+）ELSC与MSC的流式检测胞仪检测细胞检测ELSC的表面标志物表达，结果ELSC表达CD73、C纯度均高于95%，白细胞分化抗原CD14、造血干细胞特异性标志物性，表达低于5%。而在干性标志物的表达上，ELSC表达Nanog（21.29%）、SSEA-4（81.07%）、Sox-2（71.23%），而MSC组基本不表达N-2（均低于5%），低表达SSEA-4（8.13%）。

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