仿生骨界面微观形貌聚乳酸纤维膜的制备及对rBMSCs成骨分化的影响

发布时间：2020-09-25 22:09

　　 [目的]以前期课题组成员表征的骨界面微观形貌为指导,通过静电纺丝(electrostatic spinning,ES)技术,仿生制备具有近似骨界面微观形貌的聚乳酸(Polylactic Acid,PLA)纤维膜并观察其对大鼠骨髓间充质干细胞(rat bone mesenchymal stem cells,rBMSCs)增殖、黏附、铺展、成骨分化的影响,探讨仿生的微观形貌是否能促进rBMSCs成骨分化,旨在获得微观形貌高度模拟天然骨界面,骨诱导能力和生物相容性良好的骨损伤修复支架材料。[方法]1、仿生聚乳酸纤维膜的制备、表征、参数测量将聚乳酸、氯仿以不同比例混合溶解均匀,通过该调节电纺参数:电压、接受距离、接收时间,制备微观形貌不同的聚乳酸纤维膜。利用低真空环境扫描电镜对经梯度脱水临界点干燥后的纤维膜样品进行高分辨成像并随机选取15样本进行纤维直径测量;采用压汞法测定支架孔隙率。以课题组成员前期利用扫描电子显微镜(scanning electron microscope,SEM)表征、获得骨界面的部分形貌参数(胶原纤维直径)为指导,筛选出微观形貌仿生的聚乳酸纤维膜。2、骨髓间充质干细胞分离、培养、鉴定使用全骨髓贴壁法分离纯化SD大鼠BMSCs,进行体外扩增、传代培养。分别通过免疫荧光技术、流式细胞术,利用小鼠抗大鼠单克隆抗体FITC-anti-Mouse/Rat CD 44、PE--anti-Mouse/Rat CD45、APC--anti-Mouse/Rat CD90,标记并鉴定 SD 大鼠P2代BMSCs表面分子标志,验证获得细胞为骨髓间充质干细胞,为后续细胞与聚乳酸纤维膜共培养实验提胞保证。3、不同形貌聚乳酸纤维膜上的细胞行为及成骨分化检测选择适宜的P2-P4代rBMSCs细胞,分别在A组(直径357±32nm),B组(直径164±13nm)、C组(直径1311±93nm)、Ctrl组(无形貌空白对照)上接种培养。扫面电镜(SEM)观察rBMSCs在聚乳酸纤维膜上的生长、铺展、融合情况;苏木紫染色观察rBMSCs在聚乳酸纤维膜上的存活情况;CCK-8试剂盒检测rBMSCs在聚乳酸纤维膜上的增殖、黏附情况;qRT-PCR检测Runx2(runt-related transcription factor 2,Runx2)、Ⅰ 型胶原(collagen type Ⅰ,COLI)、碱性磷酸酶(alkalinephosphatase, ALP)、锌指结构转录因子(Osterix,Osx ) mRNA的表达;WB检测骨桥蛋白(Osteopontin, OPN)、骨钙素(osteocalcin, OCN)的表达。观察聚乳酸纤维膜生物相容性及不同形貌纤维膜对骨髓间充质干细胞增殖、黏附、成骨分化的影响。[结果]1、通过改变聚乳酸浓度(4%-5%);静电纺丝参数电压(18kv-22kv);接收距离(12cm-15cm);接收时间(1h-2h)得到了纤维直径60nm-1300nm,不同形貌的聚乳酸纤维膜。分别以电纺参数(4.5%, 22kv,15cm,1h), (4.5%,22kv,15cm,2h),(5%,22kv, 15cm,1h),(5%,22kv, 15cm, 1h)制备的直径分别为164±13nm,182±37nm, 326±27nm,357±32nm纤维膜,纤维粗细均匀,形成类似于细胞外基质中胶原纤维形成的网络结构,可认为是形貌仿生纤维膜,其中直径198-365nm(326±27nm,357±32nm)的纤维膜更接近仿生。2、P1代的BMSCs培养培养24h后,部分细胞贴壁,细胞呈多角形,少量成类椭圆短梭型外观,见细胞少数集落,培养48h后细胞集落增大增多,总体细胞密度较前呈倍数增长,培养72h后细胞呈现典型的纺锤体样外观,较多的贴壁细胞相互靠近融合,放射状或旋涡状。培养第5天后的细胞集落彼此靠近并融合连成片。原代培养的rBMSCs于5-7d达80～90%融合可传代,rBMSCs传代后(1:3传代)3天左右能到达80～90%融合,可再次传代,传代后细胞生长良好。荧光免疫检测显示P2代BMSCs的CD90、CD44呈阳性表达,CD45为阴性荧光着色,流式细胞术检测显示P2代BMSCs的CD45-PE、CD44-FITC、CD90-APC表达率分别为1.65%、94.1%和95.8%,符合间充质干细胞的典型生物学特征。3、苏木紫染色显示:细胞在聚乳酸纤维膜上生长良好;SEM显示:细胞爬附于三种聚乳酸纤维膜表面生长良好,十多个至数十个细胞形成一个集落,细胞与细胞之间联系紧密,A组(直径357±32nm) , B组(直径164±13nm )纤维膜上细胞具有明显聚集区域,细胞向四周散发式生长,细胞伸出突起相互连接,集落铺展较C组(直径1311±93nm)及普通培养板组充分,数量较多,尺寸较大。典型细胞形态观察发现A组(直径357±32nm),B组(直径164±13nm )较C组(直径1311±93nm)及普通培养板组,细胞铺展面积更大、细胞伪足更多,且细胞嵌入纤维膜表面,伪足和纤维黏合紧密在A组(直径357±32nm)最为明显;CCK-8增殖实验显示,第1、3、5天,普通培养板对照组、A组(直径357±32nm)、B组(直径164±13nm )增值均优于C组(直径1311±93nm),差异均具有统计学意义(P0.05),三组间对比,普通培养板对照组优于A组、B组,差异具有统计学意义(P0.05) , A组、B组二组间对比,A组高于B组,但差异无统计学意义(P0.05);在第7、9天,普通培养板对照组、A组(直径357±32nm)、B组(直径164±13nm )增值均优于C组(直径1311±93nm),差异均具有统计学意义(P0.05),三组间对比,普通培养板对照组优于A组、B组,差异具有统计学意义(P0.05),A、B二组间对比,A组优于B组差异具有统计学意义(P0.05);黏附实验显示:在4h,普通培养板对照组优于C组(直径1311±93nm)差异具有统计学意义(P0.05),其余各组间差异无统计学意义(P0.05),在 8h 和 16h,A 组(直径 357±32nm)、B 组(直径 164±13nm )、C (直径1311±93nm)三组不如普通培养板对照组,差异具有统计学意义(P0.05) , A、B、C三组间对比A、B组均高于C组差异具有统计学意义(P0.05),A、B二组间对比差异无统计学意义(P0.05);成骨分化检测显示:A组(直径 357±32nm),ALP、COLI、Runx2、OSXmRNA 表达量均明显高于 B 组(直径164±13nm )、C组(直径1311±93nm)及普通培养板对照组,低于阳性对照组;B组(直径164±13nm )、C组(直径1311±93nm)及普通培养板对照组,低于阳性对照组。[结论]1.分别以电纺参数(4.5%,22kv,15cm,1h),(4.5%,22kv,15cm,2h),(5%,22kv,15cm,1h),(5%, 22kv,15cm,1h)制备的直径分别为 164±13nm,182±37nm,326±27nm,357±32nm纤维膜,纤维粗细均匀,形成类似于细胞外基质中胶原纤维形成的网络结构,可认为是形貌仿生纤维膜,其中直径为326±27nm,357±32nm的纤维膜更接近仿生2.纤维膜形貌影响rBMSCs铺展形态、面积,直径357±32nm的纤维膜上,细胞明显区域聚集、向四周散发式生长、铺展面积更大、细胞伪足更多。3.直径为357±32n和164±13nm纤维膜与直径为1311±93nm纤维膜相比,能促进细胞黏附、增殖。4.纤维膜微观形貌影响骨髓间充质干细胞成骨分化,仿生制备的直径为357±32nm的纤维膜具有明显的成骨诱导能力。
【学位单位】：昆明医科大学
【学位级别】：硕士
【学位年份】：2017
【中图分类】：R318.08;R68
【部分图文】：

原理图,静电纺丝,原理

其原理是聚合物溶液或熔体在强电场中进行喷射纺丝。在电场作用下，针头处的逡逑液滴会由球形变为圆锥形（即＂泰勒锥＂），并从圆锥尖端延展得到纤维细丝，这种逡逑方式可以生产出纳米级直径的聚合物细丝（图２）。１９３４年，Ｆｏｒｍａｌａｓ发明了用逡逑静电力制备聚合物纤维的实验装置标志着静电纺丝技术制备纤维的开端。近年逡逑来，采用静电纺技术制备的聚合物纳米纤维己经广泛应用在皮肤、血管、软骨、逡逑骨、神经等组织工程研究领域。通过调节其工艺参数制备出的三维多孔纳米纤维逡逑膜具有纤维直径与组织基质中的胶原蛋白尺寸相近、表面积大，孔隙率高类似于逡逑天然细胞外基质的纤维膜［２｜’２２］，在在医学组织工程领域广阔的应用前景［２３’２４］。逡逑影响静电纺丝的因素主要有：聚合物的分子量分子结构等；溶液性质；接收逡逑电压大小；接收距离；环境参数（温度，湿度等）；收集装置；喷丝口针头形状。逡逑其中溶液组成、电压、接收距离、接收装置是主要的影响因素，通过调节以上参逡逑数，可制备出成膜面积大，直径从纳米到微米可调，孔隙率高、纤维连续性好、逡逑堆积密度可控的纤维膜。结合课题组成员前期利用扫描电子显微镜（ｓｃａｎｎｉｎｇ逡逑ｅｌｅｃｔｒｏｎ邋ｍｉｃｒｏｓｃｏｐｅ，邋ＳＥＭ）表征、获得骨界面的形貌参数，选择微观形貌合适聚乳逡逑酸纤维膜

静电纺丝

２．将纺丝液注入纺丝装置中的注射器内（１９号针头，直径１．４ｍｍ），流速逡逑设置为１．５ｍＬ／ｈ，调节接收距离（１２－１５ｃｍ），电压（１８－２２ｋｖ），接受时间（ｌ－２ｈ）逡逑制备聚乳酸纤维膜（图３，邋４），将纤维膜真空千燥，裁剪，收集备用。逡逑ｌｉｅＳＶＭＢ逡逑图３：静电纺丝机逦图４：静电纺丝机工作逡逑Ｆｉｇ．邋３邋Ｅｌｅｃｔｒｏｓｔａｔｉｃ邋ｓｐｉｎｎｉｎｇ邋ｍａｃｈｉｎｅ逦Ｆｉｇ．４邋Ｅｌｅｃｔｒｏｓｐｉｎｎｉｎｇ邋ｍａｃｈｉｎｅ邋ｗｏｒｋ逡逑１７逡逑

扫描电镜样品,喷金,纤维膜

，２；逡逑２．用导电胶布将纤维膜粘于导电基台上（图５），抽真空后对纤维膜喷金逡逑处理，喷金电流为４５邋ｍＡ，过程为３０邋ｓ，连续喷金２次；逡逑３．加速电压２０邋ｋＶ行扫描电镜，不同倍数放大，选择合适图片拍照（图６）。逡逑

【参考文献】