多孔二氧化硅负载BMP-2质粒通过自噬促进成骨细胞分化的研究

发布时间：2020-09-27 14:59

　　 由创伤、感染、肿瘤等引起的口腔颌面部骨缺损,严重影响患者的身心健康。在纳米材料促成骨作用的研究中,本课题组证明了多孔二氧化硅纳米粒子负载BMP-2质粒在体内具有良好的促骨形成效果,表明该纳米粒子具有较好的生物学活性,但是,其在细胞内的命运和所涉及机制还有待阐明。本研究通过体外实验,探究自噬在多孔二氧化硅纳米粒子促进小鼠颅骨来源前成骨细胞(MC3T3-E1)成骨分化中的作用,为该纳米粒子的促骨形成机制的研究提供实验基础。首先,我们采用反相微乳液法合成聚乙烯亚胺修饰的多孔二氧化硅纳米粒子(PEI modified porous silica nanoparticles,PPSNs)。扫描电镜下及透射电镜下观察PPSNs呈树枝状,多孔,分散性良好,尺寸主要分布在110-230 nm,动态光散射测得该粒子带正电,理论上可以与带负电的质粒结合。流式细胞术检测PPSNs对MC3T3-E1细胞凋亡的影响,发现PPSNs会引起细胞凋亡,且呈浓度依赖性,但是达到较高浓度时细胞存活率仍在80%以上,提示材料生物相容性较好。ELISA实验中,利用PPSNs、BMP-2质粒(简称pBMP-2)、PPSNs负载BMP-2质粒(简称PPSNs/pBMP-2)转染MC3T3-E1细胞,未在pBMP-2组的上清液中检测到BMP-2蛋白的表达,考虑是质粒进入细胞后被溶酶体消化致无效转染,因此将分组设为空白组、实验组(PPSNs组、PPSNs/pBMP-2组)。接着,我们进行细胞自噬水平的检测,通过透射电镜观察细胞内自噬体,可见实验组中自噬体数量较空白组多;吖啶橙染色观察细胞内酸性囊泡,发现实验组内酸性囊泡增多;Western Blot观察自噬相关蛋白水平的变化,显示实验组内LC3-I向LC3-Ⅱ的转换率上升,且PPSNs/pBMP-2组上升更加明显,以上结果均提示PPSNs、PPSNs/pBMP-2具有促进MC3T3-E1细胞自噬的作用。最后,我们利用3-甲基腺嘌呤抑制细胞自噬并检测成骨相关基因的表达,Real-Time PCR结果显示自噬抑制剂处理组ALP和Col1表达较未用抑制剂处理组下降,但是与空白组相比,PPSNs/pBMP-2组内ALP和Col1水平仍较高,说明PPSNs刺激自噬和pBMP-2表达共同促进成骨细胞分化。综上所述,PPSNs、PPSNs/pBMP-2能够通过自噬促进MC3T3-E1细胞成骨分化。
【学位单位】：吉林大学
【学位级别】：硕士
【学位年份】：2019
【中图分类】：R783.1
【部分图文】：

细胞术检测细胞凋亡率变化。逡逑２．２．３邋ＥＬＩＳＡ筛选实验分组逡逑通过ＥＬＩＳＡ实验确定实验分组。如图２．３所示，与空白对照组相比，；逡逑转染进入细胞后无法在上清液中检测到ＢＭＰ－２蛋白的表达，考虑其被溶酶体降解逡逑而导致无效转染。而ＰＰＳＮｓ组及ＰＰＳＮｓ／／？５ＭＰ－２组均可以促进细胞ＢＭＰ－２蛋白的逡逑表达，且ＰＰＳＮｓ／；＾ＭＰ－２组上清液内ＢＭＰ－２蛋白浓度更高（Ｐ＜０．０１）。因此，我们逡逑将实验设为空白组，ＰＰＳＮｓ组和ＰＰＳＮｓ／／？５ＭＰ－２组。逡逑１３逡逑

逦ＰＰＳＮｓ逦ｐＢＭＰ－２邋ＰＰＳＮｓ／ｐＢＭＰ－２逡逑图２．３邋ＰＰＳＮｓ，邋ｐＳ／ＷＰ－２和ＰＰＳＮｓ／ｐＳＭＰ－２处理细胞后ＢＭＰ－２蛋白的表达。逡逑ＰＰＳＮｓ，邋ｐＳＭＰ－２和ＰＰＳＮｓ／ｐＢＭＰ－２转染细胞２４ｈ后，ＥＬＩＳＡ检测上清液中ＢＭＰ－２逡逑蛋白的表达。（＊Ｐ＜0．0５；邋＊＊Ｐ＜０．０１．）逡逑２．２．４邋ＴＥＭ观察材料的胞内分布逡逑通过透射电镜观察材料进入细胞后分布。如图２．４所示，ＰＰＳＮｓ通过内吞进入逡逑细胞（红色＊），部分ＰＰＳＮｓ或ＰＰＳＮｓ／ｔ＾ＭＰ－２邋（红色＊）存在于细胞质中。有趣的逡逑是，我们在组发现细胞质内溶酶体明显增多（黄色＊）。逡逑幽＿逡逑ＰＰＳＮｓ逦ＰＰＳＵ？ｌｐＢＭＰ－２逡逑ｍｍ逡逑图２．４邋ＰＰＳＮｓ，／ｏＳ／ＷＰ－２和ＰＰＳＮｓ／ｐＳ／ＷＰ－２的胞内分布。ＰＰＳＮｓ，邋ｐＢ／ＷＰ－２逡逑和ＰＰＳＮｓ／ｐＢ／ＷＰ－２转染细胞２４ｈ后，ＴＥＭ观察细胞内材料的分布（红色＊）及溶逡逑酶体的增多（黄色０。逡逑１４逡逑

蛋白的表达。（＊Ｐ＜0．0５；邋＊＊Ｐ＜０．０１．）逡逑２．２．４邋ＴＥＭ观察材料的胞内分布逡逑通过透射电镜观察材料进入细胞后分布。如图２．４所示，ＰＰＳＮｓ通过内吞进入逡逑细胞（红色＊），部分ＰＰＳＮｓ或ＰＰＳＮｓ／ｔ＾ＭＰ－２邋（红色＊）存在于细胞质中。有趣的逡逑是，我们在组发现细胞质内溶酶体明显增多（黄色＊）。逡逑幽＿逡逑ＰＰＳＮｓ逦ＰＰＳＵ？ｌｐＢＭＰ－２逡逑ｍｍ逡逑图２．４邋ＰＰＳＮｓ，／ｏＳ／ＷＰ－２和ＰＰＳＮｓ／ｐＳ／ＷＰ－２的胞内分布。ＰＰＳＮｓ，邋ｐＢ／ＷＰ－２逡逑和ＰＰＳＮｓ／ｐＢ／ＷＰ－２转染细胞２４ｈ后，ＴＥＭ观察细胞内材料的分布（红色＊）及溶逡逑酶体的增多（黄色０。逡逑１４逡逑

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本文编号：2828024