利用生物支架诱导鼠骨髓间充质干细胞分化胰岛素分泌细胞

发布时间：2020-10-10 00:08

　　研究目的:近年来的组织工程学类器官研究为1型糖尿病的治疗提供了工程学依据和新思路。类器官作为一种体外细胞培养系统,可分化为多个器官特异性的细胞类型,具有和其对应的器官所类似的空间结构,并能够重现对应器官的部分功能。静电纺丝生物支架具有微米或纳米级纺丝结构,能够作为细胞生长、分化的载体,模拟细胞外基质,为细胞提供生长空间,对于胰岛类器官培养系统的建立具有组织工程学意义。为了能够稳定提供促进骨髓间充质干细胞诱导分化的生长因子,本研究通过材料表面聚多巴胺改性粘附方法,制备负载艾塞那肽的明胶聚乳酸静电纺丝纤维膜,用于诱导骨髓间充质干细胞向胰岛素分泌细胞分化,观察材料表面细胞增殖能力和相容性,测定其胰岛素分泌功能,旨在为胰岛样类器官的研究提供组织工程体系实验依据,并提供糖尿病治疗的新思路。研究方法:本研究使用静电纺丝技术制备明胶聚乳酸静电纺丝纤维膜支架,通过材料表面聚多巴胺改性粘附方法得到聚多巴胺改性的明胶聚乳酸静电纺丝膜,进而制备负载艾塞那肽的明胶聚乳酸静电纺丝纤维膜。通过红外光谱测定方法分析负载艾塞那肽的明胶聚乳酸静电纺丝纤维膜的化学组成。使用扫描电镜、接触角测定等方法,对三种支架材料进行理化性质评价。为了评价负载艾塞那肽静电纺丝膜支架的细胞增殖能力和细胞相容性,并应用于进一步的诱导分化,本实验分离并培养大鼠原代骨髓间充质干细胞,流式细胞检测其表型以鉴定其纯度。体外利用负载艾塞那肽静电纺丝膜支架接种培养骨髓间充质干细胞,扫描电镜观察材料表面细胞形貌,检测细胞增殖水平,分析各纺丝膜的生物相容性。结果显示,负载艾塞那肽静电纺丝膜具有较好的生物相容性和细胞增殖能力。本实验使用负载艾塞那肽明胶聚乳酸静电纺丝膜接种培养骨髓间充质干细胞,选择国内外使用较为广泛的三步法对接种于复合膜材料的骨髓间充质干细胞进行胰岛素分泌细胞的诱导分化。通过双硫腙染色、实时定量PCR、免疫荧光和ELISA方法,检测所得细胞的胰岛素、C肽、PDX-1、PAX-4、GLUT2等胰岛素相关的关键基因和蛋白的表达。研究结果:本实验通过红外光谱测定,证实了聚多巴胺改性方法制备的聚多巴胺改性的明胶聚乳酸静电纺丝膜上存在有聚多巴胺层,经过二次改性,艾塞那肽能够被负载于静电纺丝膜上。对聚多巴胺改性的明胶聚乳酸静电纺丝膜进行BSA蛋白吸附量测定结果显示,在反应120分钟时的BSA累计吸附量显著增加,由此推算各孔中几乎全部的艾塞那肽均能够负载于聚多巴胺改性的明胶聚乳酸静电纺丝膜上。接触角测定结果显示,与单纯明胶聚乳酸膜相比,负载艾塞那肽明胶聚乳酸静电纺丝膜的接触角明显减小。可以推测,负载艾塞那肽明胶聚乳酸静电纺丝膜的结构比单纯明胶聚乳酸静电纺丝膜亲水性更强,更有利于细胞表面粘附。使用负载艾塞那肽明胶聚乳酸静电纺丝复合膜接种培养培养骨髓间充质干细胞,测定其细胞相容性和增殖水平。扫描电镜和荧光染色结果显示,骨髓间充质干细胞在负载艾塞那肽明胶聚乳酸静电纺丝膜、聚多巴胺改性的明胶聚乳酸静电纺丝膜和单纯明胶聚乳酸膜上呈扁平生长,弥散分布,三种纺丝膜表面的细胞生长形态基本相同,表明负载艾塞那肽明胶聚乳酸静电纺丝复合膜能够为骨髓间充质干细胞提供了良好的细胞黏附支架环境。MTT比色法评价骨髓间充质干细胞在负载艾塞那肽明胶聚乳酸静电纺丝复合膜上细胞增殖能力结果显示,负载艾塞那肽明胶聚乳酸静电纺丝复合膜和单纯明胶聚乳酸膜均能支持骨髓间充质干细胞的黏附和增殖,说明该支架具有较好的细胞相容性,且相同时间与单纯明胶聚乳酸膜相比,MTT结果显示一定程度上能够促进骨髓间充质干细胞的增殖。以上结果与接触角测定结果相一致。双硫腙定性染色结果显示,无支架诱导的胰岛素分泌细胞上观察到被双硫腙染为红棕色的团状胰岛素表达细胞,同时存在不规则形态的细胞表现为红棕色阳性表达,间接表现所得细胞能够产生富含锌离子的胰岛素颗粒。可以推测,采用三步法体外诱导鼠骨髓间充质干细胞分化细胞能够具有胰岛素表达功能,因此将此方法使用于负载艾塞那肽静电纺丝膜诱导骨髓间充质干细胞分化。实时定量PCR结果显示,和常规无支架诱导的胰岛素分泌细胞相比,负载艾塞那肽的静电纺丝膜对于骨髓间充质干细胞向胰岛素分泌细胞的诱导分化具有一定促进作用,其机制可能与提高PDX-1、Pax-4、glut2的表达相关。免疫荧光检测和ELISA结果进一步验证,与无支架诱导胰岛素分泌细胞和对照组未诱导鼠骨髓间充质干细胞相比,负载艾塞那肽明胶聚乳酸静电纺丝复合膜诱导胰岛素分泌细胞中胰岛素、C肽、PDX-1的相对荧光强度明显升高(P均0.05)。通过免疫荧光定性检测和半定量测定结果显示,和常规无支架诱导的胰岛素分泌细胞相比,负载艾塞那肽的静电纺丝膜能够提高骨髓间充质干细胞向胰岛素分泌细胞诱导分化的胰岛素表达水平,对其诱导分化具有一定促进作用,其机制可能与提高PDX-1蛋白表达量相关。结论:(1)使用多巴胺改性方法,艾塞那肽能够被负载于明胶聚乳酸静电纺丝膜上且吸附率较高。(2)负载艾塞那肽明胶聚乳酸静电纺丝复合膜结构与单纯明胶聚乳酸膜相比,亲水性更强,更有利于细胞表面粘附。(3)扫描电镜和钙黄绿素染色结果显示,骨髓间充质干细胞能够在负载艾塞那肽明胶聚乳酸静电纺丝复合膜上较好粘附和铺展生长。(4)MTT结果显示负载艾塞那肽明胶聚乳酸静电纺丝复合膜一定程度上能够促进骨髓间充质干细胞的增殖。(5)和常规无支架诱导的胰岛素分泌细胞相比,负载艾塞那肽的静电纺丝膜能够提高骨髓间充质干细胞向胰岛素分泌细胞诱导分化的胰岛素表达水平,对其诱导分化具有一定促进作用。
【学位单位】：吉林大学
【学位级别】：博士
【学位年份】：2019
【中图分类】：R587.1;R318.08
【部分图文】：

示意图,技术路线,示意图

本研究技术路线示意图

示意图,静电纺丝,制备装置,示意图

乳酸(Poly-L-lactic-acid, PLLA, Mw = 30000)，分别加入上胶的 10ml 溶剂，37-40℃水浴条件下，使用磁力搅拌器 10 ml 已溶有明胶的溶剂。依次配制为明胶：聚乳酸（w1P1)、2:1(G2P1)的不同浓度的聚合物溶液备用。酸静电纺丝纳米纤维膜：将混合溶液注入 5 毫升针头注泵装置对聚合物溶液进行喷丝，推进速度为 0.5 ml/小时V、15 KV、20 KV 高压电源，测试不同电压参数对纤维极与喷丝装置相连接，电压阴极与采集铝箔相连接，采，采集距离约 20 cm，室温下制备静电纺丝纤维膜。为了的溶剂，将制备的静电纺丝纳米纤维膜在 37℃的真空干直径 2.3 mm 或 0.9 mm 的圆形，紫外灭菌处理后无菌条中使用。图 2.1 所示为静电纺丝制备装置。

静电纺丝,表面形貌,平均直径,扫描电镜图

以备后续不同实验中使用。图 2.1 所示为静电纺丝制备装置。图 2.1 静电纺丝制备装置示意图2.2.3 不同条件制备静电纺丝的理化检测① 在 3kv 加速电压条件下，用扫描电镜（SEM）观察支架的表面形貌。② 对扫面电镜图像进行处理，每个区域统计 100 根纤维，利用 Image-Pro Plus软件(Media Cybernetics, Rockville, MD, USA)对纳米纤维的直径分布进行了定量测

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