以天然蛋白丝为载体的CTC捕获及其毛细管电泳筛选CTC的核酸适配体

发布时间：2020-10-13 23:52

　　 本文第一部分以天然蚕丝为载体,表面改性后用作捕获器捕获循环肿瘤细胞(CTC),并对其捕获性能进行了研究。基于蚕丝和壳聚糖良好的生物相容性和各自的反应活泼性,尝试将两者联用,采用滴注的方法将壳聚糖覆膜在蚕丝表面,使蚕丝表面带有大量活性氨基,再通过碳二亚胺法依次连接聚丙烯酸(PAA)和核酸适配体(Apt)构建成捕获蚕丝。将其固定在静脉留置针中,前端伸出2厘米改性蚕丝用于捕获。以蠕动泵构建循环系统,模拟体内血液循环,将细胞悬液加入循环体系中考察捕获器的捕获性能。由于此覆膜方法得到的壳聚糖膜在蚕丝上分布较少且不均匀,捕获结束后在覆膜部位可见明显的细胞堆积,而在无膜部位则少见细胞,造成整体的捕获效率不高。为提升捕获效率,利用蚕丝蛋白中氨基酸分子侧链上的氨基和羧基等基团,通过环氧键的开环反应接枝上1,4 丁二醇二缩水甘油醚(MSDS),使蚕丝表面带上一层均匀的活性环氧键,再通过开环反应连接上长链PAA,最后通过碳二亚胺法连接Apt。各步反应均以傅里叶红外变换光谱仪及扫描电镜进行表征。本章重新构建了循环捕获系统用于体外模拟,考察了此改性丝的捕获效率及特异性。此捕获器捕获效率较好,特异性较高。实验中还研究了不同数量蚕丝对捕获效果的影响,发现蚕丝数量越多,捕获效果越好,近似呈指数形式增长,在蚕丝数量足够的情况下,将展现出极强的捕获能力。另测试了该捕获器的细胞毒性和生物相容性,其仅有极轻的细胞毒性,不造成溶血和凝血,说明其具有用于体内捕获癌细胞的潜质。本文第二部分对聚丙烯酰胺凝胶电泳技术与基于细胞的指数富集的配体系统进化技术(Cell-SELEX)联用方法进行了研究,尝试以细胞凝胶毛细管电泳进行靶细胞的核酸适体筛选。实验中捕获器捕获CTC建立在适体识别并结合癌细胞的基础上,一种适体仅特异性识别某种特定的癌细胞,尚有大量的癌细胞有待筛选出各自的特异性核酸适配体。传统的适体筛选耗时较长,且操作复杂,因此本文提出一种新方法,并对该新型的、快速的筛选技术完成了初步的可行性研究,为进一步的研究工作提供了良好的基础。将靶细胞与聚丙烯酰胺胶混合后注入涂层毛细管内,使细胞凝胶在毛细管柱内聚合,以嵌入式荧光激发模式检测信号,将FAM标记的原始文库电进样进入细胞凝胶毛细管柱内电泳分离。对聚丙烯酰胺胶的类型、浓度,电泳电压,和进样时间进行了优化,决定电泳条件为:10%非交联聚丙烯酰胺胶,电泳电压400V/cm,电进样时间20s。在进行方法学验证时发现,由于细胞表面的蛋白种类丰富,数量众多,电泳中同一种ssDNA由于接触到的蛋白种类和数量各不相同,在各个保留时间都有出现,因此并不能简单地根据信号峰的先后判断ssDNA与细胞的亲和力强弱,即亲和力存在差异的ssDNA链无法分开。
【学位单位】：苏州大学
【学位级别】：硕士
【学位年份】：2018
【中图分类】：R318
【部分图文】：

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图３．静脉留置针捕获示意图［５２］??
【参考文献】

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本文编号：2839872