功能化自组装多肽水凝胶在延缓犬椎间盘退变中的作用

发布时间：2020-10-21 20:48

　　 背景当今社会,许多患者都饱受下腰痛的困扰。下腰痛不但降低患者生活质量,使患者丧失劳动能力,也过多消耗着有限的医疗经济资源。研究表明,椎间盘退变(intervertebraldiscdegeneration,IDD)是造成下腰痛的主要原因之一。目前治疗腰椎间盘退变的主要方法分为保守治疗和手术治疗两种。然而,以药物理疗为主的保守治疗只能减轻患者疼痛,无法阻止椎间盘的退变进程;作为保守治疗无效后的首选治疗手段,手术治疗的疗效虽较为持久,但术后复发及相邻阶段退变问题使患者备受困扰。通过增强椎间盘内细胞自身修复,延缓椎间盘退变成为医学界关注的热点之一。骨形态发生蛋白质7(bone morphogenetic protein7,BMP-7)即成骨蛋白-1(osteogenicprotein-1,OP-1),可促进髓核细胞分泌蛋白多糖和II型胶原,还可促进髓核细胞的增殖以及向软骨细胞分化。然而,BMP-7作为生长因子单独使用时,其半衰期较短,需要多次注射才能维持作用,且椎间盘内直接注射BMP-7还存在成骨风险。新型自组装多肽纳米纤维支架材料RADA16-I(AcN-RAD ARAD ARAD ARADA-CNH)可将具有不同功能的生物活性多肽短片段复合在其C端末端,从而提高其生物学活性。本研究前期将具有BMP-7功能的短多肽片段(KPSSAPTQLN)通过化学键方式结合在RADA16-I的C端,从而构建出功能化自组装多肽纳米纤维水凝胶支架材料RADA-KPSS,再通过将RADA-KPSS与RADA16-I以1:1比例混合,形成新型功能化自组装多肽纳米纤维水凝胶支架材料RADKPS。研究表明,RADKPS在体外可明显促进退变髓核细胞中蛋白多糖和Ⅱ型胶原的合成,且持续时间显著长于单体BMP-7。本课题组前期体外实验证明,RADKPS具有良好的细胞相容性、血液相容性及组织相容性。为进一步探索RADKPS在椎间盘退变中所起到的延缓和修复能力,本研究在低温下将RADKPS注射入椎间盘缺损退变的动物模型中,并检测其修复效果,为未来其临床应用提供实验依据。目的:1.建立犬椎间盘退变的模型。2.通过动物实验观察RADKPS延缓椎间盘退变的作用。方法:1.选取1岁龄健康的杂种犬(10-15 kg),进行X线及核磁共振(MRI)检查对椎间盘整体情况进行评价,筛选出无明显脊柱畸形、椎间盘整体情况良好的16只犬作为实验对象。2.16只成年杂种犬,每只选取4个椎间盘(L3-4、L4-5、L5-6,L6-7)。穿刺制作椎间盘退变模型。L7-S1椎间盘作为正常对照组不作任何处理。3.犬退变椎间盘治疗干预:待椎间盘造模4周后,通过MRI检查测定椎间盘髓核区域以及相对部位脑脊液的灰度值,计算相对灰度值指数(relative gray index,RGI),确认造模后椎间盘相对灰度值RGI比造模前明显下降,且均一良好,保证造模后四组间椎间盘(L3-4、L4-5、L5-6,L6-7)相对灰度值RGI无显著差异(p0.05)。分组:L6-7 注射 BMP-7,L5-6 注射 RADKPS,L4-5 注射 PBS,L3-4注射不含活性方片段的RADA-16。4.在造模前4周,造模后4周,干预治疗后4周、8周、12周均进行MRI检查测定椎间盘相对灰度值RGI。以干预手术的时间点定位0点,时间依次记录为-4w、0w、4w、8w、12w。在-4w、0w、12w进行X线检测测定椎间盘相对高度指数DHI%。5.组织学检查:在12w,影像学检查结束后采用注射氯胺酮将犬安乐死;将犬的L3至S1脊柱联合周围软组织共同分离;将每一个椎间盘髓核组织给予石蜡包埋切片;分别进行HE染色、Ⅱ型胶原免疫组化染色和蛋白多糖免疫组化染色。6.生化成分检测:在12 w,采用注射氯胺酮将犬安乐死。将犬L3至S1脊柱联合周围软组织共同分离;从椎间盘横行切开;分离出髓核组织;通过ELISA蛋白定量检测蛋白多糖及Ⅱ型胶原的含量。结果:1.在-4w时,纳入实验的椎间盘均一性良好,无先天退变。在Ow时,各椎间盘(L3-4、L4-5、L5-6,L6-7)造模成功,均一性退变而正常对照组无退变。在12w时RGI值:正常对照组RADKPS组BMP-7组RADA-16组PBS 组(P0.05)。在 4w、8w、12w时,BMP-7 组、RADA16-I 组、PBS组RGI值均随着作用时间而降低(P0.05)。RADKPS实验组和正常对照组RGI值在相同时间周期内并无显著差异(P0.05)。2.X线:在-4w、0w和12w时进行X线检测,L3到L7的4个椎间盘高度均有所下降;在12 w时,椎间盘相对高度指数DHI%:正常对照组RADKPS组BMP-7 组RADA-16组PBS组(P0.05)。3.HE染色:正常对照组的髓核组织均一深度红染,含有大量团簇样细胞,分布均匀;RADKPS实验组的髓核组织染色较为均一,可见少量团簇样细胞;BMP-7对照组与RADA16-I对照组的髓核组织团簇样细胞消失,髓核组织结构紊乱;PBS对照组的髓核组织细胞数量明显减少,组织逐渐被胶原所取代。4.免疫组化染色:RADKPS实验组髓核组织蛋白多糖与Ⅱ型胶原深染,染色程度明显高于BMP-7组,RADA-16组,PBS组。分别计算其平均光密度AOD值均显示:正常对照组RADKPS实验组BMP-7对照组RADA-16对照组PBS对照组(P0.05)。5.Elisa蛋白定量检测分析:蛋白多糖与Ⅱ型胶原均显示:正常对照组RADKPS实验组BMP-7对照组RADA-16对照组PBS对照组(P0.05)。结论在椎间盘退变早期,RADKPS多肽水凝胶具有延缓退变的作用。相较于直接注射RADA-16和BMP-7,RADKPS继承了 RADA-16在椎间盘内代谢缓慢,持久发挥作用的特性,且具有同BMP-7直接注射水平相当的良好生物活性。一方面,RADKPS的作用可能与其促进椎间盘内髓核细胞分泌蛋白多糖和Ⅱ型胶原的机制有关。
【学位单位】：南方医科大学
【学位级别】：硕士
【学位年份】：2019
【中图分类】：R318.08;R681.53
【部分图文】：

图２－１为犬进行手术前的准备??Ａ．术前的备皮?Ｂ．术前的划线??Ｆｉｇｕｒｅ２－１?ｓｈｏｗｓ?ｔｈｅ?ｐｒｅｐａｒａｔｉｏｎ?ｏｆ?ｔｈｅ?ｄｏｇ?ｂｅｆｏｒｅ?ｓｕｒｇｅｒｙ??Ａ．Ｓｋｉｎ?ｐｒｅｐａｒａｔｉｏｎ?ｂｅｆｏｒｅ?ｓｕｒｇｅｒｙ?Ｂ．Ｐｒｅｏｐｅｒａｔｉｖｅ?ｍａｒｋｉｎｇ??２．２椎间盘造模手术过程??采取速眠新盐酸赛拉嗦注射液＼盐酸氯胺酮注射液联合肌肉注射的方法进行??麻醉。按照每公斤体重０．３?ｍｌ盐酸赛拉嗦注射液、０．４ｍｌ盐酸氯胺酮注射液将两??者混合，在犬大腿处，或者臀大肌处注射所需总量的２／３。在肌肉注射前需进行??回抽，然后用木棍固定犬的上下颌，并将舌头拽出，以免在麻醉过程中舌后坠，??发生室息。采取右侧卧位，用绑带固定住犬的头部和四肢，头部用绷带固定犬尖??牙处，四肢需固定至肘关节以上部位，防止手术中动物挣脱。于胫骨外侧的胫骨??下动脉建立静脉通入。然后给与生理盐水术中补液，防止犬术中体液丢失过多，??补液量２００?ｍｌ，在术中２?ｈ内输入完毕。同时在术中以０．３５?ｍｌ／ｋｇｈ的速度输入??

Ｉ國瞧＾?％?％??ｎｐｐｎｐｐｐ?丨?ｌｉｉｉｉｉｉｉｐｐｐｍｐｉｉｐｉ！??＾ＹＷ?Ｓ９＇?１０！?１?１２?１??图２－３手术过程中从椎间盘内吸出的胶冻状物质－髓核组织。??Ｆｉｇｕｒｅ?２－３?Ｎｕｃｌｅｕｓ?ｐｕｌｐｏｓｕｓ，?ａ?ｇｅｌａｔｉｎｏｕｓ?ｓｕｂｓｔａｎｃｅ，?ｗａｓ?ａｓｐｉｒａｔｅｄ?ｆｒｏｍ?ｔｈｅ?ｉｎｔｅｒｖｅｒｔｅｂｒａｌ?ｄｉｓｃ??ｄｕｒｉｎｇ?ｓｕｒｇｅｒｙ．??１６??

?麵??图２－２手术过程中进行穿刺造模??Ｆｉｇｕｒｅ?２－２?ｐｕｎｃｔｕｒｅ?ｍｏｌｄｉｎｇ?ｗａｓ?ｐｅｒｆｏｒｍｅｄ?ｄｕｒｉｎｇ?ｔｈｅ?ｏｐｅｒａｔｉｏｎ??Ｉ國瞧＾?％?％??ｎｐｐｎｐｐｐ?丨?ｌｉｉｉｉｉｉｉｐｐｐｍｐｉｉｐｉ！??＾ＹＷ?Ｓ９＇?１０！?１?１２?１??图２－３手术过程中从椎间盘内吸出的胶冻状物质－髓核组织。??Ｆｉｇｕｒｅ?２－３?Ｎｕｃｌｅｕｓ?ｐｕｌｐｏｓｕｓ，?ａ?ｇｅｌａｔｉｎｏｕｓ?ｓｕｂｓｔａｎｃｅ，?ｗａｓ?ａｓｐｉｒａｔｅｄ?ｆｒｏｍ?ｔｈｅ?ｉｎｔｅｒｖｅｒｔｅｂｒａｌ?ｄｉｓｃ??ｄｕｒｉｎｇ?ｓｕｒｇｅｒｙ．??１６??
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本文编号：2850583