静电纺丝纳米纤维负载脂肪组织提取物构建“三明治”结构仿生补片应用于膀胱壁修复的研究

发布时间：2020-10-21 22:34

　　 第一部分脂肪组织提取物对干细胞、内皮细胞生长分化以及大鼠创口愈合的影响背景与目的:组织工程和再生医学是修复组织器官缺损、实现其解剖学和功能学再生的重要途径之一。而实现大面积、长距离的组织修复和替代,移植物内干细胞的生存和活性以及新生组织的血管化尤为重要。脂肪组织不仅是储能器官,还是庞大的内分泌器官,其中富含脂肪源性细胞因子,具有一定的生物活性和生理功能。本部分研究拟采用方便易行的方法提取脂肪组织提取物(ATE),研究其对间充质干细胞和内皮细胞生长分化以及对创口愈合的影响,并探讨其在组织修复中的应用价值。方法:取成年SD大鼠腹股沟处皮下脂肪提取ATE,并提取大鼠脂肪源干细胞(ADSCs)、骨髓间充质干细胞(BMSCs)和血管内皮细胞(ECs)。以ATE培养两类干细胞,CCK-8法检测其对干细胞增殖的影响,并检测细胞内干性蛋白标志物Sox-2、Oct-4和Nonag的表达以评价ATE对其多向分化潜能的影响。以ATE培养ECs,通过CCK-8、划痕实验、Transwell迁移实验、Matrigel体外成管实验评价其对内皮细胞增殖、迁移以及成管化的影响。进一步地,我们将其与透明质酸(HA)混合共溶制备含有ATE的冻干海绵(ATE/HA),并作为敷料覆盖于大鼠背部皮肤创口上,以观察其在组织修复中的作用并行组织切片分析其修复过程中炎性指标CD45和血管化指标CD31。另外,我们使用细胞因子芯片对ATE这一脂肪源性细胞因子复合体进行了成分分析,以探索和讨论其产生相关生物学效应可能的机制。结果:通过ATE对干细胞的培养,ADSCs和BMSCs的增殖较高于不添加ATE的对照组,且其干性蛋白标志物表达也一定程度地增多。通过ATE对ECs的培养,ECs的增殖亦有所增强。划痕实验中ATE培养的实验组细胞迁移距离大于对照组(85.92±15.52mm vs 35.33±24.85mm,p0.05),Transwell迁移实验中实验组迁移细胞的数量多于对照组(19.8±4.8/hpf vs 1.2±0.8/hpf,p0.05),Matrigel体外成管化实验中实验组小管平均周长和面积均大于对照组(426.61±91.47mm vs 266.06±72.90mm,p0.05;13314.29±6784.42mm~2 vs 5082.76±2433.00mm~2,p0.05)。动物实验中,覆盖含ATE敷料的创口修复速度快于对照组,且第10天时免疫组化显示,ATE组中CD31和CD45的表达均较高。细胞因子芯片对ATE进行成分检测,结果显示ATE中含有脂联素、血管内皮生长因子、白介素、脑源性神经营养因子、巨噬细胞源性趋化因子等诸多细胞因子。结论:ATE中含有诸多脂肪源性细胞因子,具有一定的生物活性。它可一定程度上促进干细胞增殖,维持干细胞的多向分化潜能。同时,ATE对ECs的增殖、迁移和成管化具有一定的促进作用。另外,ATE可促进创伤修复和愈合,这可能与其促进血管新生有关。因此,ATE有一定潜能作为一种生物添加剂,应用于组织工程修复和再生。第二部分脂肪组织提取物负载至静电纺丝纳米纤维制备“三明治”结构补片修复膀胱壁的研究背景与目的:各种先天或后天因素可能导致膀胱的损伤或缺失,膀胱组织工程被认为是未来修复大面积膀胱缺损乃至替换膀胱的途径之一。然而膀胱具有一定的储尿和排尿功能,如何实现新生膀胱的功能化是目前膀胱组织工程领域亟待解决的问题。新生膀胱组织中内皮细胞的迁移和血管化、尿路上皮细胞和膀胱平滑肌细胞的迁入和生长,被认为是实现膀胱功能性修复的关键因素。静电纺丝是组织工程中常用的制备纳米纤维膜的方法之一。载药纳米纤维不仅可以实现结构上的修复,又能根据不同的需要而负载相关药物、蛋白、细胞因子、纳米颗粒等等,使之具备一定的生物活性,从而满足功能性修复的需求。脂肪组织提取物(ATE)中富含脂肪源性细胞因子,具有一定的促细胞增殖、迁移以及促血管生成能力。因此,在本部分实验中,我们尝试将ATE负载至聚乳酸-聚己内酯(PLCL)电纺纳米纤维膜上构建具有一定生物活性的“三明治”结构仿生补片,以期实现膀胱的解剖学和功能学修复。方法:静电纺丝法制备PLCL纳米纤维膜,ATE与透明质酸(HA)混合制备ATE/HA溶液,涂布包被于PLCL纤维膜并冻干制备得“三明治”结构纳米纤维补片(ATE/HA-PLCL),进行扫描电镜观察,并行力学性能测试和接触角检测以评价其材料学特征。行大鼠皮下移植评测其组织相容性。进一步地,我们制作了大鼠膀胱缺损模型,并以ATE/HA-PLCL补片进行修复,以PLCL补片作为对照,术后8周进行Micro-CT扫描、尿动力学检测,评价修复后膀胱的功能。另外,我们在术后8周进行组织切片检测,以HE染色、Masson染色以及CD31免疫组化染色观察其尿路上皮和平滑肌生长情况以及新血管生成情况。结果:制得的ATE/HA-PLCL纳米纤维补片纤维直径763±31nm,孔隙率为82.7±2.4%,ATE/HA层呈多孔海绵结构,且两层之间相互融合连接紧密。力学性能检测其杨氏模量为15.35±1.47MPa,亲水性检测其接触角为87.7±1.8°。大鼠皮下移植4周后见材料部分生物降解,未见明显CD45、CD68阳性炎细胞浸润。膀胱修复实验中,术后8周后,经Micro-CT扫描ATE/HA-PLCL组膀胱内未见明显膀胱结石生成,而对照的PLCL组可见少量结石影附着于膀胱壁。尿动力学检测结果显示ATE/HA-PLCL组膀胱容量具有大于PLCL组膀胱容量的趋势(1.53±0.36m L vs 1.16±0.30m L,p=0.07),而明显大于Blank组膀胱容量(1.53±0.36m L vs 0.84±0.30m L,p0.05)。在膀胱顺应性上,ATE/HA-PLCL组优于PLCL组(0.30±0.10m L/cm H2O vs0.18±0.13 m L/cm H2O,p0.05)。HE染色见ATE/HA-PLCL组尿路上皮呈复层结构且连续,Masson染色见肌性纤维组织增多,免疫组化提示ATE/HA-PLCL组新生膀胱壁内具有较多微小血管生成。结论:负载有ATE的PLCL纳米纤维补片具有较好的力学特征和组织相容性。其运用于膀胱大面积修复时可促进尿路上皮的覆盖、平滑肌的生长以及新血管的生成,可一定程度上地实现膀胱的解剖学和功能学修复,在膀胱组织工程领域具有一定的研究价值和应用潜力。
【学位单位】：华中科技大学
【学位级别】：博士
【学位年份】：2019
【中图分类】：R318.16
【部分图文】：

图 1.1 ADSCs 光镜下形态（A. 原代 ADSCs；B. ADSCs 融合；bar=50 m）SCs 的表面抗原鉴定 P3 代 ADSCs 进行流式细胞术表面抗原检测，结果如图 1.2。间充质干抗原标志物 CD29、CD44、CD90 表达呈阳性，表达率分别为 99.6%、血细胞相关表面抗原 CD34、淋巴细胞相关表面抗原 CD44 表达呈阴性为 5.3%和 4.9%，符合间充质干细胞表面抗原特征。CD29 CD44 CD90B CDE

图 1.1 ADSCs 光镜下形态（A. 原代 ADSCs；B. ADSCs 融合；bar=50 m）1.2 ADSCs 的表面抗原鉴定取 P3 代 ADSCs 进行流式细胞术表面抗原检测，结果如图 1.2。间充质干细胞相关表面抗原标志物 CD29、CD44、CD90 表达呈阳性，表达率分别为 99.6%、99.5%、99.8%，血细胞相关表面抗原 CD34、淋巴细胞相关表面抗原 CD44 表达呈阴性，表达率分别为 5.3%和 4.9%，符合间充质干细胞表面抗原特征。A BA B C

图 1.3 BMSCs 光镜下形态（A. 原代 BMSCs；B. BMSCs 融合；bar=50 m）SC 的表面抗原鉴定 P3 代 BMSCs 进行流式表抗检测，结果如图 1.4。间充质干细胞相关表CD44、CD90 表达呈阳性，表达率分别为 94.9%、85.4%、95.6%， 达呈阴性，表达率分别为 10.5%和 10.0%，符合间充质干细胞表面抗CD29 CD44 CD90B CD E
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本文编号：2850678