猪、兔、鼠肾生物支架制备及体外HEK细胞共培养探究

发布时间：2020-10-31 22:58

　　 【目的】肾脏移植是终末期肾病的最佳替代治疗手段,受者接受肾移植后需长期服用免疫抑制剂。移植入无排异反应的人工合成组织工程肾脏可解除长期服药痛苦。猪肾因与人肾生理性能相似而倍受期待,但异种细胞共培养的物种差异还尚未见报道。本研究主要目的是灌注制备家猪、新西兰兔、SD大鼠肾脏去细胞生物支架,并探究三者肾支架对异种共培养种子细胞人胚肾上皮细胞(HEK)的影响。【方法】健康成年家猪10头、新西兰白兔28只、SD大鼠28只,分别将获取的肾脏随机均等分为正常组和支架组,支架组由肾动脉依次灌入肝素、1%Triton X-100和1%SDS溶液完成去细胞化。两组肾脏分别作组织形态学鉴定并检测机械力学性质。去细胞支架作组织爬片与人胚肾上皮细胞共培养,观察细胞在支架爬片上的生长状况,免疫荧光检测人胚肾上皮细胞PCNA及DAPI表达量,并收集荧光图片作灰度分析。【结果】家猪、新西兰白兔、SD大鼠肾脏经灌注去细胞后HE核染色阴性,Masson染色显示胶原蛋白阳性,Collagen I和Collagen IV荧光染色阳性,三种物种肾正常组DNA含量远高于支架组DNA含量,差异有统计学意义(P0.05);电镜扫描可见去细胞支架内蜂窝状孔洞结构,并可见典型的肾小球龛样结构;支架组肾杨氏模量与正常组相比差异无统计学意义;HEK细胞荧光染色图像灰度分析显示家猪、新西兰白兔、SD大鼠肾支架组PCNA/DAPI值高于空白对照组,差异有统计学意义(P0.05),而三组支架组之间PCNA/DAPI值对比差异无统计学意义。【结论】本研究灌注去细胞方法可去除家猪、新西兰白兔、SD大鼠肾脏内的细胞及细胞核,保留细胞外基质,维持细胞外基质的三维空间结构和机械力学强度,是一种可靠有效的制备家猪、新西兰白兔、SD大鼠肾脏去细胞生物支架方法,灌注制备的去细胞支架均可提高异种共培养人胚肾上皮细胞HEK的增殖活性,且这种提高作用在家猪、新西兰白兔和SD大鼠之间并无物种差异性。
【学位单位】：南华大学
【学位级别】：硕士
【学位年份】：2018
【中图分类】：R318
【文章目录】：
摘要
Abstract
主要缩略词中英文索引
第1章 绪论
第2章 材料与方法
    2.1 实验动物和细胞、生化试剂耗材及仪器设备
    2.2 主要实验试剂的配制
    2.3 实验方法
        2.3.1 动物肾脏获取
        2.3.2 肾脏去细胞化
        2.3.3 DNA检测
        2.3.4 组织学HE及Masson染色
        2.3.5 免疫荧光染色
        2.3.6 电镜扫描
        2.3.7 拉伸试验
        2.3.8 细胞培养及细胞支架共培养
        2.3.9 细胞免疫荧光
        2.3.10 统计分析
第3章 实验结果
    3.1 大体形态观测及组织学和免疫组织化学鉴定
    3.2 DNA检测
    3.3 扫描电镜检测
    3.4 拉伸试验
    3.5 细胞支架共培养
第4章 讨论
第5章 结论
参考文献
文献综述
    参考文献
攻读硕士学位期间科研成果
基金
致谢

【参考文献】

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本文编号：2864627