光控定向细胞片技术的构建及相关机制分析

发布时间：2020-11-01 15:14

　　 组织工程技术的发展为器官移植供体短缺提供了潜在的解决方案。细胞片技术是“自下而上”组织工程学策略的重要组成部分,在细胞无损收割、薄层组织替代治疗及细胞密集型三维组织构建中具有重要价值。然而如肌肉、骨骼、血管和神经等组织,其生理功能的实现与细胞及细胞外基质结构的有序性密切相关因此,为了更好地构建功能化仿生组织,需要获得细胞及细胞外基质方向可控的细胞片,并开发有效的细胞片转移操控系统。光控细胞片技术利用TiO_2光响应特点可以高效无损地收割细胞片,本文以光控细胞片技术为基础,构建了功能一体化的光控细胞片操控体系,包括光控细胞排列、光控细胞片脱附、光敏凝胶辅助细胞片转移和叠加等,并对其生物学性能及机制进行了研究。首先我们论证了TiO_2纳米点薄膜具有光照功能化特征,即合适的紫外光预处理可以提高纳米点的生物活性,促进蛋白及细胞粘附。而掩膜版下光照处理则得到了微图案化的生物活化区域,细胞在微图案化表面表现出定向伸展和有序排列的行为。通过对光照处理后的样品表面分析,明确了光生表面羟基介导了这一生物活化过程,即光照局部端羟基比例增加吸引了更多基质蛋白的沉积,并最终影响了细胞粘附和伸展的行为。据我们所知,这是首次将TiO_2光照功能化现象应用于细胞微图案化调控。将定向排列的细胞继续培养至完全汇合,其方向性被保存了下来,再次紫外光处理,由于基板表面的亲水性改变及光生羟基作用,外层蛋白与基板脱离,可以获得包含部分外层蛋白的定向细胞片。实验证实,通过该方式收割的定向细胞片具有良好的生物活性和统一的方向性。我们分析了细胞感受光控微图案化表面的机制,以进一步认识和优化光控细胞定向技术。本研究引入了“快速傅里叶变换”的图像处理方法来获取细胞排列的定量化数据。通过分析微图案化表面的几何参数与细胞排列之间的关系,明确了细胞与条带之间的尺寸关系是影响细胞定向排列的重要因素,并基于此获得了更多细胞类型的定向细胞片。进而从单个细胞层面观察了微图案化表面细胞的粘附和伸展情况,明确伪足在细胞感受外周环境中的重要作用。通过抑制细胞骨架相关蛋白及通路,我们认为MyosinⅡ/ROCK通路介导的细胞伪足回缩,是实现光控微图案化表面定向排列的重要机制。由于直接脱附的定向细胞片操控性较差,而独特的收缩特性也限制了其进一步应用,我们将光聚合水凝胶GelMA整合到光控细胞片脱附、转移和叠加过程中。实验证明,在GelMA的辅助下,定向细胞片脱附效率增加,脱附的细胞片可长期保养于体外,并分泌具有方向性的细胞外基质,并可以影响与之共培养的其他细胞。在脱附的定向HFF-1细胞片表面定植HUVECs,后者不仅呈现方向性排列,同时形成了更好的微血管结构,我们认为这与HFF-1定向细胞片表达了更高水平的成血管方面基因VEGFA和ANG-1有关。最后,GelMA还可以操控不同方向的定向细胞片叠加,构建具有复杂结构的三维组织。GelMA辅助系统的引入使光控细胞片技术真正成为了功能整合的有机整体,为其更大的应用奠定了基础。
【学位单位】：浙江大学
【学位级别】：博士
【学位年份】：2018
【中图分类】：R318
【部分图文】：

是由材料表面的化学组成引起的。Ｔｉ０２表面缺陷容易吸附环境中的水分子形成表??面羟基［９Ｑ］，因此，我们对光照前后样品进行了表面羟基构成的分析及比较。通过??对氧的ＸＰＳ结果进行分峰分析，如图３．１Ｃ和Ｄ所示，其中５３２．２ｅＶ附近的峰属??于端羟基Ｔｉ－ＯＨ中的氧，即为表面羟基中的氧；位于５３１．０ｅＶ附近的峰为桥羟基??ＴｉＯＨ中的氧，而靠近５２９．４?ｅＶ附近的峰则为Ｔｉ０２中的氧，即Ｔｉ－Ｏ－Ｔｉ［９０，９１］。对上??述各峰面积进行积分，总和记为氧总量，而各峰面积同氧总量的比即各个状态氧??的比例分布，如表３．１，可以看到光照处理后，样品中表面羟基所占比例增加了约??５％。结果与我们的推断一致，即Ｔｉ０２纳米点光照亲水性的改变与光生羟基的作用??有关。由于在常规培养环境中，溶液的ｐＨ值常大于羟基等电点，光照处理后的样??品具有更多的表面羟基，因此带有更多负电荷，更易吸引蛋白中带正电的氨基，??同时材料表面的羟基使吸附蛋白构型发生变化

我们从润湿性，蛋白粘附和细胞粘附三个层面来验证这一假设。??由于图案化的润湿效果不易以接触角的结果显示，我们选择采用水蒸汽凝结??实验［９２］反映润湿性效果。图３．２Ａ显示在未照射组，水蒸汽以水滴的形式分散地凝??结于样品表面，而经过紫外辐照处理后的样品，由于亲水性增加，水珠可以迅速??的铺展至整个样品表面。在掩膜版光照组，水珠则依照掩膜版图形铺展成了栅状，??因为未辐照的条带保持疏水性限制了水的流动。因此我们首先从润湿性角度证实??了?ＴｉＣｈ纳米点表面的微图案化。??在蛋白吸附层面，我们分别进行了定性及定量评价。血清白蛋白是体液环境??及体外培养条件中最常见蛋白，因此选用牛血清白蛋白（ＢＳＡ）作为模型进行实??验。绿色荧光接枝的ＢＳＡ吸附结果直观的反映了蛋白吸附的微图案化。通过焚光??图片可以看到清晰的平行蛋白条带，而且蛋白条带和间隙的宽度都近似为５０ｐｍ，??这一数据与掩膜版上的图案宽度一致。进而，蛋白吸附的定量实验（图３．２Ｂ）显??示，光照处理明显增加了?Ｔｉ０２纳米点薄膜的蛋白吸附能力，达到１．１４?ｎｇ／ｍｌ，而对??应的未光照俎则为不足０．８０?ｎｇ／ｍｌ。掩膜版光照组的结果位于二者之间

是一种有效地在ＴｉＣｈ纳米点薄膜表面构建微图案化线索的方式，而这一微线索，??指导了后续的蛋白粘附和细胞行为。结合上一部分对Ｔｉ０２纳米点光照功能化原理??的分析，我们用图示的方式描绘了光控微图案化的原理。图３．３Ａ表示的是Ｔｉ０２??纳米点光生轻基的产生过程，吸收光能后，ＴｉＣｈ产生光电子，将四价钬还原成三??价钬，而空穴则氧化０２＿离子形成氧空位，空气中的水解离吸附在氧空位上成为形??成端羟基（表面羟基），而随着黑暗中长期放置，Ｔｉ０２表面会失去水分子重新恢复??到光照前状态。图３ＢＣＤ分别代表了全光照、未光照及微图案化光照组样本的表??面构成及蛋白和细胞吸附状态。更多的表面羟基有利于初始蛋白的粘附，而蛋白??的粘附则是细胞粘附的基础。而在微图案化表面，细胞和蛋白的区域化粘附则归??因于光生羟基的图案化分布。??Ａ?Ｂ?ＣＤ??：?ｒ?ｔ??Ｄａｒｋ?＇?？?＾＇＂＇Ｖ??ＴｉＯＨＢ?ＴｉＯＨＴ?．“，ｖ?■？？？？■，??＾?Ｍ?Ｔ?Ｔ?Ｔ?？?！?？?Ｉｌｌ?＊?＊?Ｔ＾??ｐｒｏｔｅｉｎ?ｃｅｌｌ?Ｔｉ?＃?？?？?Ｈ??图３．３光控细胞定向机制示意图。（Ａ）光照前Ｔｉ０２表面以桥羟基（ＴｉＯＨＢ）为主，吸收??紫外光照产生光生电子和０２－
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本文编号：2865717