人羊膜间充质干细胞在短肽水凝胶中的三维培养研究
发布时间：2020-11-02 20:56
目的探讨人羊膜间充质干细胞(human amniotic mesenchymal stem cells,h AMSCs)在短肽水凝胶中的生长状况、增殖能力、干性基因表达及成骨分化研究。方法1)对水凝胶RGD(Ac N-RADARADARADARADA-GG-RGDSP-CONH2),TTS(Ac N-RADARADARADARADA-GG-TTSWSQ-CONH2),FOG(Ac N-RADA RADARADARADA-GG-FOGER-CONH2)分别采用透射电镜、圆二色光谱和流变学分析行表征检测;1%上述3种肽依次分别与1%RADA16按3:7、3:7及2:8混合得到RAD/RGD、RAD/TTS及RAD/FOG,超声并4℃保存。2)采用两酶分步消化法分离h AMSCs,并行贴壁培养、纯化细胞至P3代,运用流式细胞术、免疫细胞化学染色、细胞形态学及定向诱导分化对h AMSCs进行鉴定;将h AMSCs培养至P3代,用于后续与自组装短肽水凝胶共培养实验。3)实验分为5组:2D组(2D Group,2D)、G1组(纯RADA16)、G2(RAD/RGD,RADA16:RGD=3:7)、G3组(RAD/TTS,RADA16:TTS=3:7)及G4组(RAD/FOG,RADA16:FOG=2:8);建立h AMSCs与G1、G2、G3及G4组水凝胶细胞支架复合体以及二维对照组模型,倒置相差显微镜观察各组细胞形态;采用Live/Dead检测细胞在支架中的存活情况;CCK-8和Ed U检测细胞在支架中的增殖活性;流式细胞术检测各组细胞周期情况;随后运用茜素红染色评估成骨分化效应;采用q PCR对比分析h AMSCs于水凝胶及2D环境中培养第8天时干性基因Nanog、Oct-4a和Rex-1的m RNA表达情况,并探讨Runx2、Osx、BSP、ALP、Col1α1和Ocn基因的7天、14天、21天成骨分化相关转录水平的变化。结果1)圆二色谱检测和透射电镜发现RGD、TTS和FOG三种自组装短肽在溶液中均可形成β-折叠的二级结构,并最终形成宽约7nm,长几百μm的纳米纤维;流变学检测显示,储能模量(G′)大于损耗模量(G″),表明它们能够形成水凝胶。RADA16分别与上述3种水凝胶混合后能快速自组装成均质、透明及弹性外形的水凝胶。2)h AMSCs传代至第3代,细胞具有呈长索状、螺旋状生长的典型间充质形态;h AMSCs表达CD44、CD73、CD90、CD105及波形蛋白,不表达或低表CD34、CD19、CD45、CD11b、HLA-DR;茜素红染色显示,成骨诱导后细胞存在矿化结节;经油红O染色,成脂诱导后细胞质内可见脂滴聚集;甲苯胺蓝染色显示,成软骨诱导后细胞基质中分泌大量的糖胺聚糖。3)h AMSCs在各组水凝胶支架中80%以上存活且均匀分散生长;CCK-8和Ed U实验检测显示h AMSCs在3D条件下较2D培养增殖较慢,可能与h AMSCs在水凝胶中处于静息状态有关,随后行细胞周期进一步验证,h AMSCs于水凝胶中70%以上处于G0/G1期,而处于S期细胞较少(21%左右),Ed U数据显示增殖能力G1G2G3G4与细胞周期实验处于S期细胞百分率数据相吻合;与2D相比,水凝胶促进干性基因Nanog、Oct-4a、Rex-1及成骨分化基因Runx2、Osx、BSP、ALP、Ocn和Col1α1的m RNA表达。结论1)h AMSCs体外扩增培养后接种到水凝胶中,与2D培养环境相比,细胞增殖减慢。2)h AMSCs接种到水凝胶中培养第8天行实时荧光定量PCR检测,与2D培养条件相比,干细胞的干性基因m RNA表达量上调。3)在一定成骨诱导后,自组装短肽支架成骨分化基因的m RNA表达量上调。
【学位单位】：遵义医学院
【学位级别】：硕士
【学位年份】：2018
【中图分类】：R318
【部分图文】：
RGD、TTS 及 FOG 稀释成 0.05%，取 10 μL 稀释 1％的磷钨酸负染后，抽真空待其干燥后使用透学分析RGD、TTS 及 FOG 稀释成 0.5%，混合均匀后，每中央。在室温、应变为 0.5％、恒定 1HZ 频率的储扫描参数检测。维凝胶形成观察RGD、TTS、FOG 均可在一定时间内自组装成均 1.1 括号部分）。
图 1.2 自组装短肽 CD 光谱。Fig 1.2 CD examination of 0.01% of self-assembling peptides in (A) aqueous solution and (B) 50mM PBS (pH7.2).2.3 透射电子显微镜结果图 1.3 的 TEM 结果显示，水凝胶 RGD、TTS 及 FOG 溶液经 1%磷钨酸负染后，均能自组装成相互交联的纳米网状纤维结构，纳米支架孔径约为 5-200nm，直径约 8-10 nm 不等。
图 1.2 自组装短肽 CD 光谱。Fig 1.2 CD examination of 0.01% of self-assembling peptides in (A) aqueous solution and (B) 50mM PBS (pH7.2).2.3 透射电子显微镜结果图 1.3 的 TEM 结果显示，水凝胶 RGD、TTS 及 FOG 溶液经 1%磷钨酸负染后，均能自组装成相互交联的纳米网状纤维结构，纳米支架孔径约为 5-200nm，直径约 8-10 nm 不等。
【参考文献】
本文编号：2867560
【学位单位】：遵义医学院
【学位级别】：硕士
【学位年份】：2018
【中图分类】：R318
【部分图文】：
RGD、TTS 及 FOG 稀释成 0.05%，取 10 μL 稀释 1％的磷钨酸负染后，抽真空待其干燥后使用透学分析RGD、TTS 及 FOG 稀释成 0.5%，混合均匀后，每中央。在室温、应变为 0.5％、恒定 1HZ 频率的储扫描参数检测。维凝胶形成观察RGD、TTS、FOG 均可在一定时间内自组装成均 1.1 括号部分）。
图 1.2 自组装短肽 CD 光谱。Fig 1.2 CD examination of 0.01% of self-assembling peptides in (A) aqueous solution and (B) 50mM PBS (pH7.2).2.3 透射电子显微镜结果图 1.3 的 TEM 结果显示，水凝胶 RGD、TTS 及 FOG 溶液经 1%磷钨酸负染后，均能自组装成相互交联的纳米网状纤维结构，纳米支架孔径约为 5-200nm，直径约 8-10 nm 不等。
图 1.2 自组装短肽 CD 光谱。Fig 1.2 CD examination of 0.01% of self-assembling peptides in (A) aqueous solution and (B) 50mM PBS (pH7.2).2.3 透射电子显微镜结果图 1.3 的 TEM 结果显示，水凝胶 RGD、TTS 及 FOG 溶液经 1%磷钨酸负染后，均能自组装成相互交联的纳米网状纤维结构，纳米支架孔径约为 5-200nm，直径约 8-10 nm 不等。
【参考文献】
相关期刊论文 前2条
1 Christina McKee;Mick Perez-Cruet;Ferman Chavez;G Rasul Chaudhry;;Simplified three-dimensional culture system for long-term expansion of embryonic stem cells[J];World Journal of Stem Cells;2015年07期
2 Sufang Han;Yannan Zhao;Zhifeng Xiao;Jin Han;Bing Chen;Lei Chen;Jianwu Dai;;The Three-Dimensional Collagen Scaffold Improves the Sternness of Rat Bone Marrow Mesenchymal Stem Cells[J];遗传学报;2012年12期
本文编号：2867560
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