渐进性梯度孔径骨软骨支架的制备及性能研究

发布时间：2020-11-03 14:17

　　 目的:制备SF-CS-nHAp渐进性梯度孔径OC支架并完成其性能检测,以期为OC缺损的修复提供一种更加合适的仿生复合支架。方法:分别制备浓度分别为2%、3%、4%的SF溶液、CS溶液及nHA悬液,将相同浓度的材料等比例混合,分为支架-1(2%)、支架-2(3%)、支架-3(4%)三组。采用离心、真空冷冻干燥及化学交联法,经过三次塑形,制备出浓度不同的渐进性梯度孔径OC支架。分别检测各组支架一般情况、孔隙率、吸水膨胀率、压缩吸水膨胀率、热水溶失率、溶失后吸水膨胀率、力学性能、支架内部结构观察及孔径大小,并分析得出整体性能较好的支架。采用胶原酶消化法提取山羊ADSCs,通过免疫荧光法及流式细胞术对其进行鉴定,并通过CCK-8法检测ADSCs增殖活性。制备支架浸提液,通过CCK-8法检测不同时间段支架浸提液对ADSCs增殖活性的影响。将ADSCs种植在支架中构建成支架-ADSCs复合体,并通过CCK-8法检测支架-ADSCs复合体中各层细胞增殖情况,通过细胞核荧光染色法及SEM观察支架-ADSCs复合体中各层细胞分布及形态。结果:各组支架均呈白色,形状规则,近似为圆柱体,质量极轻,触之有一定的抗压能力及弹性。支架-1、支架-2、支架-3孔隙率分别为(91.30±3.35)%、(89.50±3.11)%、(82.58±1.47)%,支架-3孔隙率则低于另外两组(P0.05);吸水膨胀率分别为(3218.53±84.37)%、(2573.83±132.51)%、(1969.50±90.01)%,并且随材料浓度增高而逐渐减小(P0.05);压缩吸水膨胀率分别为(1587.27±63.09)%、(2379.53±77.04)%、(1989.53±118.90)%,与压缩前吸水膨胀率相比,支架-1明显降低(P0.05),支架-2及支架-3无明显变化(P0.05);热水溶失率分别为(16.57±3.18)%、(15.03±2.17)%、(15.65±0.68)%,各组间相比无明显差异(P0.05),回归分析显示支架在体外完全溶失,分别需要65.85、60.92、73.86周;溶失后吸水膨胀率分别为(4267.15±132.31)%、(3192.30±223.41)%、(2807.70±235.16)%,与溶失前吸水膨胀率相比,三组支架溶失后吸水膨胀率均明显升高(P0.05);弹性模量分别为(0.0955、0.1762、0.3468)MPa;SEM显示各组支架内部均呈现为蜂窝状,孔隙形状规则、互通,从支架成软骨侧到成骨侧孔隙分布逐渐密集、孔隙直径逐渐减小(P0.05)。通过胶原酶消化法提取的ADSCs形态均一,形状似纺锤形,呈漩涡样生长,细胞增殖活性良好。流式细胞术鉴定ADSCs细胞表型结果显示CD29、CD90、CD44阳性表达率均为90%以上,而CD34、HLA-DR、IgG-Isotype control、Blank阳性表达率均小于5%,免疫荧光结果与流式鉴定结果一致。支架细胞毒性检测结果显示,不同时间段的支架浸提液对ADSCs的增殖活性均无明显影响,RGR值均大于90%,毒性评级均在0至Ⅰ级之间。支架-ADSCs复合体各层细胞在培养第3d后开始出现对数期增殖,第11d后进入平台期,在培养的第5-15d,复合体成软骨侧的细胞增殖活性稍高于成骨侧(P0.05)。DAPI染色后可观察到支架各层内细胞分布均匀,细胞核形态大小均一,细胞核无明显异染及碎裂现象;SEM观察到支架-ADSCs复合体各层孔隙内壁上可见大量细胞粘附,细胞形态大小均一,呈长梭形紧密排列,未出现明显的细胞破碎或形态异常。结论:本研究成功制备出渐进性梯度孔径OC支架,支架各项物理性能良好,符合正常OC由软骨层向骨层的渐进性梯度结构。本研究成功提取纯度较高的ADSCs,并且成功构建支架-ADSCs复合体,经检测支架无细胞毒性并且生物相容性良好。综上,本研究所制备的SF-CS-nHAp渐进性梯度孔径OC支架及支架-ADSCs复合体,有望成为修复OC缺损的新型仿生复合支架材料。
【学位单位】：遵义医科大学
【学位级别】：硕士
【学位年份】：2019
【中图分类】：R318.08
【部分图文】：

图 1 SF-CS-nHAp 渐进性梯度孔径 OC 支架的制备方法及物理性能检测示意图（1）SF 溶液制备 将 SF 置于三元溶液[摩尔比 CaCl2：H2O：C2H5OH=1：8：2]中，在 80℃、300rpm 条件下，磁力搅拌 1h 左右溶解。溶解后将溶液转移至截留分子量

图 2 山羊 ADSCs 提取、培养、鉴定及活性检测示意图（1）ADSCs 提取及培养 取山羊 1 只，采用 10%水合氯醛（300mg/kg）对其进行腔内注射麻醉，无菌取腹股沟区脂肪组织约 4g。将脂肪组织迅速转移至超净台，

图 3 SF-CS-nHAp 渐进性梯度孔径 OC 支架的生物相容性检测示意图（1）支架体外细胞毒性实验 根据物理性能检测结果分析并选择更为合适的支架进行体外细胞毒性试验。将成功制备的支架通过环氧乙烷灭菌，再用含 1%双抗的无菌1×PBS 溶液在 37℃条件下恒温震荡处理（即 PBS 缓冲液平衡支架酸碱度）3d。将处
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本文编号：2868689