GFP/Ferritin双标基因的磁共振成像

发布时间：2021-03-29 17:33

　　基因治疗在多种疾病的治疗领域具有重大潜力。然而基因治疗的应用却因为缺乏体内无创检测基因表达水平的方法而受到诸多限制。MRI可以提供高分辨率和组织器官的的特异性功能成像,这些特点使MRI报告基因的应用成为了监测基因表达的首选成像方式。最近几年,这方面的报道很多,包括β-半乳糖苷酶,转铁蛋白受体以及铁蛋白等的研究。其中在诸多基因中,铁蛋白,由于其不需要其他补充试剂,无细胞毒性,成为了最有吸引力的MRI报告基因。本研究希望可以构建一个GFP和重链铁蛋白双表达的载体系统,既满足体外研究的需要,也满足在体内无创成像的需要。方法：使用限制性内切酶得到铁蛋白重链基因片段,使用T4连接酶将其连接到pBI-CMV2载体中,构建成质粒pBI-GFP-mFerritin。构建成功后,经菌落PCR,酶切,测序鉴定载体。利用脂质体,将正确载体转染至MCF-7细胞中,进行免疫化学及体外功能分析,鉴定小鼠铁蛋白重链基因在细胞的表达分布。之后,将纯化好的高质量质粒,通过电转染的方式,转染到小鼠大腿。48小时后,在MR下检测T2图像。通过对大腿组织常规切片进行普鲁士蓝染色实验,显示腿部肌肉中的铁。结论：经菌落PCR和酶... 

【文章来源】：内蒙古农业大学内蒙古自治区

【文章页数】：44 页

【学位级别】：硕士

【文章目录】：
摘要
Abstract
1 引言
    1.1 分子影像和报告基因成像
    1.2 MRI原理
    1.3 MRI造影剂
    1.4 FERRITIN结构与功能
        1.4.1 Ferritin的结构
        1.4.2 Ferritin氧化还原
        1.4.3 Ferritin中铁离子的释放
    1.5 FERRITIN磁共振成像原理
    1.6 FERRITIN在MR成像中的应用
2 实验材料与方法
    2.1 质粒构建
        2.1.1 mFerritin片段的获得
        2.1.2 pBI-CMV2载体酶切
        2.1.3 连接
        2.1.4 转化
        2.1.5 菌落PCR
        2.1.6 酶切鉴定
        2.1.7 测序正确后提取质粒
        2.1.8 细菌保种
    2.2 细胞转染及MFERRITIN蛋白体外试验
        2.2.1 细胞复苏、传代和冻存
        2.2.2 细胞转染
        2.2.3 Western Blot免疫印迹实验
        2.2.4 细胞MR成像
        2.2.5 细胞GFP成像
    2.3 MFERRITIN在体内共振成像检测
        2.3.1 小鼠体内电转染实验
        2.3.2 小鼠体内MRI扫描
        2.3.3 组织切片Prussian Blue实验
3.结果
    3.1 菌落PCR
    3.2 限制性内切酶初步鉴定重组载体
    3.3 载体测序结果
    3.4 转染后GFP表达情况
    3.5 MFERRITIN-H蛋白表达的检测
    3.6 MFERRITIN-H体外表达的MR检测
    3.7 MFERRITIN-H体内表达的MR检测
    3.8 MFERRITIN-H体内表达的PRUSSIAN BLUE染色
4 讨论
    4.1 载体构建
    4.2 体外实验
    4.3 体内实验
5 结论与展望
致谢
参考文献
作者介绍



本文编号：3107909