基于MS2和Suntag系统的新型胞嘧啶碱基编辑工具的建立及其应用研究
发布时间：2021-07-17 18:13
背景和目的:基因编辑是通过缺失,插入或替换DNA片段或特定碱基,来实现基因组可编程修饰的技术,可以实现DNA的精确插入、删除或造成遗传物质的改变。目前CRISPR/Cas9技术由于其高编辑效率和操作简单被广泛用于基因组操作。单一引导RNA（sgRNA）与靶向序列结合后,Cas9蛋白在结合位点引入DNA双链断裂（DSB）。细胞通过非同源末端连接或同源重组途径修复断裂的双链。HDR能产生精确修饰,而NHEJ在结合位点产生插入和缺失（indels）,最终产生移码突变,易位或其他DNA重排导致基因破坏。此外,DSB优先通过NHEJ的途径修复,这最终导致基因组中的许多非靶向随机变化。为了避免产生DSB,研究人员开发了基于CRISPR/Cas9的另一种基因编辑策略,称为碱基编辑。胞嘧啶碱基编辑器（CBEs）由切口酶Cas9（nCas9）或催化缺陷型Cas9（dCas9）和胞嘧啶脱氨酶融合构成,在sgRNA的引导下,能在靶位点处定点产生胞嘧啶（C）到胸腺嘧啶（T）,互补链上为鸟嘌呤（G）到腺嘌呤（A）的碱基转换,同时不形成DSB。目前应用最多的CBEs的胞嘧啶脱氨酶主要是大鼠APOBEC1（rAPO...
【文章来源】：中国人民解放军陆军军医大学重庆市
【文章页数】：77 页
【学位级别】：硕士
【部分图文】：
碱基编辑系统—MS2-BE的组成
图 2-2 碱基编辑系统—MS2-BE 的编辑效率。A: 碱基编辑系统 MS2-BE 在不同 sgRNA 的靶向作用下，在-32 到 28bp (以 PAM 为原点算起)编辑窗口内的每个碱基位点编辑效率。B: 碱基编辑系统 MS2-BE 在-32 到 28bp (以 PAM 为原点算起)编辑窗口内的平均编辑效率。误差线（±）表示三次独立重复试验的标准差。2.3.3 不同 Cas9 对 MS2-BE 碱基编辑效率的影响为了优化构建的 MS2-BE 系统，我们尝试更改其中的某一组成部分。首先，考虑到 Cas9 的变体，另一个 Cas9 切口酶 nCas9（H840A) 能在 sgRNA 非互补链上产生切口。我们尝试用 nCas9（H840A) 替换 nCas9(D10A)，或使用催化失活的 Cas9（dCas9）提高 MS2-BE 系统的编辑效率。我们通过蓝白斑报告系统比较了使用不同Cas9 变体时 MS2-BE 系统的突变效率。结果显示，在三种 Cas9 变体中，dCas9 组有更高的白色菌落比例 (P <0.05)，说明在 MS2-BE 系统中用 dCas9 能获得更高的突变效率。如图 2-3 所示。
图 2-3 不同 Cas9 对 MS2-BE 碱基编辑效率的影响RNA-2X MS2，MCP-AID-UGI 和 dCas9 / nCas9（D10A）/ nCas9（pSP189 报道系统，并计算白色菌落的百分比。数据采用两因素方独立重复试验的标准差。 * P <0.05; ** P <0.01。脱氨酶对 MS2-BE 碱基编辑效率的影响 的第二个重要组成部分是脱氨酶。除了胞嘧啶脱氨酶 AGI 融合到 MCP 的 C 末端来构建 MCP-rAPOBEC1。然后我统比较了使用不同脱氨酶时 MS2-BE 系统的编辑效率。中：当使用 dCas9 时，MCP-rAPOBEC1 组的白色菌落比率高)；使用 nCas9 (D10A)获得了相同的结果 (P <0.01)；但使用 OBEC1 和 MCP-AID 组的白色菌落比例没有显著差异。这些 nCas9 (D10A)时，在 MS2-BE系统中脱氨酶 rAPOBEC1比
【参考文献】：
期刊论文
[1]A CRISPR/Cas9 toolkit for efficient targeted base editing to induce genetic variations in rice[J]. Bin Ren,Fang Yan,Yongjie Kuang,Na Li,Dawei Zhang,Honghui Lin,Huanbin Zhou. Science China（Life Sciences）. 2017(05)
本文编号：3288683
【文章来源】：中国人民解放军陆军军医大学重庆市
【文章页数】：77 页
【学位级别】：硕士
【部分图文】：
碱基编辑系统—MS2-BE的组成
图 2-2 碱基编辑系统—MS2-BE 的编辑效率。A: 碱基编辑系统 MS2-BE 在不同 sgRNA 的靶向作用下，在-32 到 28bp (以 PAM 为原点算起)编辑窗口内的每个碱基位点编辑效率。B: 碱基编辑系统 MS2-BE 在-32 到 28bp (以 PAM 为原点算起)编辑窗口内的平均编辑效率。误差线（±）表示三次独立重复试验的标准差。2.3.3 不同 Cas9 对 MS2-BE 碱基编辑效率的影响为了优化构建的 MS2-BE 系统，我们尝试更改其中的某一组成部分。首先，考虑到 Cas9 的变体，另一个 Cas9 切口酶 nCas9（H840A) 能在 sgRNA 非互补链上产生切口。我们尝试用 nCas9（H840A) 替换 nCas9(D10A)，或使用催化失活的 Cas9（dCas9）提高 MS2-BE 系统的编辑效率。我们通过蓝白斑报告系统比较了使用不同Cas9 变体时 MS2-BE 系统的突变效率。结果显示，在三种 Cas9 变体中，dCas9 组有更高的白色菌落比例 (P <0.05)，说明在 MS2-BE 系统中用 dCas9 能获得更高的突变效率。如图 2-3 所示。
图 2-3 不同 Cas9 对 MS2-BE 碱基编辑效率的影响RNA-2X MS2，MCP-AID-UGI 和 dCas9 / nCas9（D10A）/ nCas9（pSP189 报道系统，并计算白色菌落的百分比。数据采用两因素方独立重复试验的标准差。 * P <0.05; ** P <0.01。脱氨酶对 MS2-BE 碱基编辑效率的影响 的第二个重要组成部分是脱氨酶。除了胞嘧啶脱氨酶 AGI 融合到 MCP 的 C 末端来构建 MCP-rAPOBEC1。然后我统比较了使用不同脱氨酶时 MS2-BE 系统的编辑效率。中：当使用 dCas9 时，MCP-rAPOBEC1 组的白色菌落比率高)；使用 nCas9 (D10A)获得了相同的结果 (P <0.01)；但使用 OBEC1 和 MCP-AID 组的白色菌落比例没有显著差异。这些 nCas9 (D10A)时，在 MS2-BE系统中脱氨酶 rAPOBEC1比
【参考文献】：
期刊论文
[1]A CRISPR/Cas9 toolkit for efficient targeted base editing to induce genetic variations in rice[J]. Bin Ren,Fang Yan,Yongjie Kuang,Na Li,Dawei Zhang,Honghui Lin,Huanbin Zhou. Science China（Life Sciences）. 2017(05)
本文编号：3288683
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