绿色工艺制备聚乙烯亚胺衍生物在细胞支架和介导基因转染中的研究

发布时间：2017-08-09 16:21

  本文关键词：绿色工艺制备聚乙烯亚胺衍生物在细胞支架和介导基因转染中的研究

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【摘要】：聚乙烯亚胺(polyethyleneimine, PEI)作为典型的阳离子聚合物之一，已经广泛应用于组织工程支架以及作为基因转染的载体。由于PEI本身血液相容性较差，细胞毒性大等缺点严重制约了其进一步应用。利用化学方法对PEI分子改性是一种有效降低其细胞毒性和改善血液相容性的方法。生物材料通过静电纺丝技术制备的具有极大比表面积的纳米纤维可以很好地模拟天然细胞外基质，为细胞的粘附、增殖及为生理功能提供良好的微环境。 本论文结合两性离子化合物良好的生物相容性优势，设计合成两性离子化合物PEI衍生物。利用高压静电纺丝技术制备PEI-C/聚乙烯醇(polyvinyl alcohol, PVA)的低毒复合纳米纤维，考察其纤维性能和细胞毒性；研究改性后的PEI(PEI-C)作为基因载体时在水溶液中与质粒DNA(Plasmid deoxyribonucleic acid, pDNA)之间的相互作用、纳米复合物的形成、载体的生物相容性、细胞毒性及基因复合物在体外的转染等性能。 本论文的研究内容主要分为以下几个方面： （1）利用绿色化学的理念，基于富氨基类聚合物对二氧化碳有很强的吸附性这一特点，结合两性离子化合物良好的生物相容性的优势，用二氧化碳对超支化PEI25KDa进行改性，制备出聚乙烯亚胺衍生物(PEI-C)。通过核磁（NMR）、元素含量检测和傅氏转换红外线光谱分析仪（FT-IR）对所制备的衍生物进行表征确认其结构。考察二氧化碳吸收时间、PEI反应浓度等影响因素，结果表明：PEI浓度控制在20%~40%之间；当二氧化碳在通入0.5h后，PEI中氧元素含量已达到27%。MTT细胞毒性实验表明，与未修饰的PEI25K相比，，PEI-C材料的细胞的相对存活率维持在80%左右；而PEI的细胞毒性随其浓度增加，细胞存活率从80%左右降低到30%以下，表明PEI-C的细胞毒性显著降低。 （2）采用静电纺丝手段，将PEI-C和PVA制备成具有良好纤维形貌的含不同比例的PEI-C/PVA复合纳米纤维，用戊二醛蒸汽交联得到水稳定的纳米纤维膜。扫描电子显微镜（SEM）、FT-IR等手段表征其纤维膜交联前后的形貌及结构变化。通过对纺丝液浓度、电压、接收距离和流速等条件的优化，得到了具有良好纤维形貌的含不同比例的PEI-C/PVA复合纳米纤维支架。以雪旺细胞（schwann cell）为模型细胞来研究该材料的生物相容性。研究表明，雪旺细胞在PEI-C/PVA复合纤维支架表面分布相比未改性的PEI/PVA复合纤维基质更为密集，细胞形态明显较好，更利于细胞生长；MTT细胞毒性实验进一步表明，PEI-C/PVA在质量比为35：65时，纤维支架细胞的OD值为0.47，相当于同等条件下PEI/PVA纤维支架OD值的2倍，证实改性后的复合纤维支架的细胞毒性明显降低。 （3）将所制备的PEI-C材料用于介导基因转染的研究。蛋白吸附实验表明二氧化碳修饰后的PEI-C材料抵御蛋白质吸附的能力增强；脱氧核糖核酸酶I的防护和释放实验表明，PEI-C载体材料有保护pDNA免受细胞中核酸酶降解并且可以释放pDNA。使用凝胶电泳仪考察载体与pDNA的结合能力，采用动态光散射(DLS)和Zeta电位仪考察载体与pDNA形成的复合物的粒径和电位。MTT细胞毒性实验表明，与未修饰的PEI载体基因复合物(pDNA/PEI)相比，PEI-C载体基因复合物(pDNA/PEI-C)的细胞毒性显著降低；体外转染实验表明，PEI-C能够有效地介导基因转染。以Hepa1-6细胞和QBC939细胞为模型细胞，在有血清情况下，PEI-C作为载体时在Hepa1-6细胞和QBC939细胞的转染率为33%以上达到甚至高于PEI25KDa作为载体时的转染效率。随着N/P的增加，转染效率从33%左右增长到62%左右；在无血清情况下转染，其PEI-C作为载体在两种癌细胞的转染效率也维持在20%以上，比PEI25KDa作为载体时的转染效率高2.5倍左右，激光共聚焦图片也与其吻合。实验结果表明PEI-C能够有效地介导基因转染。
【关键词】：聚乙烯亚胺改性 复合纳米纤维 细胞支架 基因载体 转染
【学位授予单位】：东华大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2015
【分类号】：R318.08
【目录】：

• 摘要5-8
• ABSTRACT8-11
• 目录11-13
• 第一章 绪论13-30
• 1.1 引言13
• 1.2 聚乙烯亚胺及其衍生物13-20
• 1.2.1 聚乙烯亚胺的性质13-15
• 1.2.2 聚乙烯亚胺的应用15-16
• 1.2.3 聚乙烯亚胺的改性16-20
• 1.3 纳米纤维膜用于模拟细胞外基质20-24
• 1.3.1 细胞外基质生物材料的发展20-21
• 1.3.2 静电纺丝概述21-22
• 1.3.3 静电纺丝纳米纤维膜的应用22-24
• 1.4 介导基因转染24-28
• 1.4.1 基因转染简介24-25
• 1.4.2 非病毒基因转染载体25-27
• 1.4.3 高分子基因载体介导基因传递的一般过程27-28
• 1.5 本课题的提出及主要研究内容28-29
• 1.6 本论文工作的创新之处在于以下几个方面29-30
• 第二章 聚乙烯亚胺衍生物的制备及表征30-41
• 2.1 引言30-31
• 2.2 实验部分31-34
• 2.2.1 实验原料及仪器31
• 2.2.2 绿色合成聚乙烯亚胺衍生物 PEI-C31
• 2.2.3 13C NMR 核磁分析31-32
• 2.2.4 全反射傅里叶红外光谱仪（ATR-FTIR）分析32
• 2.2.5 热重(TG)分析32
• 2.2.6 元素分析32-33
• 2.2.7 PEI-C 材料的 MTT 实验33-34
• 2.3 结果与讨论34-40
• 2.3.1 PEI-C 的结构分析34-38
• 2.3.2 PEI-C 细胞毒性评价38-40
• 2.4 总结40-41
• 第三章 PEI-C/PVA 复合纳米纤维的制备及表征41-54
• 3.1 前言41-42
• 3.2 实验部分42-45
• 3.2.1 实验原料及仪器42
• 3.2.2 静电纺制备 PEI-C/PVA 和 PEI/PVA 复合纳米纤维42-44
• 3.2.3 PEI-C/PVA 和 PEI/PVA 复合纳米纤维膜疏水化处理44
• 3.2.4 PEI-C/PVA 和 PEI/PVA 复合纳米纤维膜的表征44
• 3.2.5 复合纳米纤维膜体外细胞毒性检测44-45
• 3.3 结果与讨论45-53
• 3.3.1 复合纳米纤维膜细胞毒性的研究45-51
• 3.3.2 体外细胞生长和细胞毒性试验51-53
• 3.4 本章小结53-54
• 第四章 PEI-C/pDNA 复合体的制备及在转染方面的应用54-68
• 4.1 引言54-55
• 4.2 实验部分55-59
• 4.2.1 实验原料及仪器55
• 4.2.2 酸碱滴定55-56
• 4.2.3 RFP 质粒 DNA 的提取56-57
• 4.2.4 pDNA/PEI-C 复合物的制备57
• 4.2.5 pDNA/PEI-C 复合物凝胶电泳实验57
• 4.2.6 pDNA/PEI-C 复合物粒径、表面电荷的测试57
• 4.2.7 透射电镜（TEM）57
• 4.2.8 蛋白质吸附实验57-58
• 4.2.9 DNase I 的保护和释放实验58
• 4.2.10 细胞毒性实验58-59
• 4.2.11 体外转染实验59
• 4.3 结果与讨论59-67
• 4.3.1 PEI-C 聚合物质子缓冲能力的研究59-60
• 4.3.2 PEI-C 聚合物与 pDNA 结合能力的研究60-61
• 4.3.3 pDNA/PEI-C 复合物粒径和电位的研究61-62
• 4.3.4 PEI-C 聚合物与蛋白质吸附作用62-63
• 4.3.5 PEI-C 聚合物对 DNA 的保护作用63-64
• 4.3.6 pDNA/PEI-C 复合物的细胞毒性评价64-65
• 4.3.7 体外细胞转染评价65-67
• 4.4 本章小结67-68
• 第五章 总结与展望68-70
• 5.1 总结68-69
• 5.2 展望69-70
• 参考文献70-81
• 硕士期间发表的论文和专利81-83
• 致谢83

【参考文献】

中国期刊全文数据库 前2条

1 卢丽萍;王芳芳;吴敏;;聚乙烯醇/壳聚糖/硝酸铈共混纤维毡的制备及其对Cr(Ⅵ)的吸附性能[J];纺织学报;2012年05期

2 张颖 ,王志 ,王世昌;Facilitated Transport of CO_2 Through Synthetic Polymeric Membranes[J];Chinese Journal of Chemical Engineering;2002年05期

本文编号：646205