ADSCs在组织工程化软组织当中的应用与研究

发布时间：2017-08-14 19:35

本文关键词：ADSCs在组织工程化软组织当中的应用与研究

【摘要】：1目的随着在组织工程技术及再生医学的发展,组织工程技术在角膜、肝、胰、软骨、骨、血管、尿道、神经系统等领域均取得了巨大的成就,而组织工程技术在整形外科的应用还处于起步阶段。具有“主动修复功能”和“可调控生物响应特性”的第三代含有干细胞的复合组织材料成为当前的研究热点和未来的发展方向。然而,目前含有干细胞的复合组织材料仍有很多问题尚未解决,如复合组织材料在组织修复再生过程中与宿主间相互作用的机理尚不清楚。材料在体内的转归、对宿主局部微环境及全身防御和再生体系的影响尚不确定等。上述问题极大地阻碍了复合组织材料的开发与应用。本实验以脂肪来源干细胞(Adipose-derived stem cells ADSCs)为种子细胞,以可以注射的游离脂肪颗粒、透明质酸凝胶(hyaluronic acid HA)为细胞支架材料,构建含有干细胞的复合组织材料。通过研究含有干细胞的复合组织材料在组织修复再生过程中与宿主的相互作用,阐明复合组织材料在体内的转归、对宿主微环境及全身的影响,揭示复合组织材料与宿主相互作用的调控机制；建立新型复合组织材料的筛选、研发的理论体系和关键技术,为临床应用提供科学依据。2方法2.1脂肪来源干细胞的分离提取培养及鉴别 1)ADSCs分离,脂肪组织来源于整形外科脂肪抽吸病人,患者自愿捐献白体脂肪组织用于本次试验。2)胶原酶消化法提取脂肪来源性干细胞,分离、收集原代ADSCs按4×105有核细胞/ml细胞密度接种于培养瓶内,常用的75mm塑料培养瓶接种细胞,加入低糖DMEM+10%FBS完全培养液培养。用胰酶消化传代,收集第3代细胞作为种子细胞和检测对象。3)流式细胞仪测定干细胞表面标记物CD34、CD49、CD105等,该方法仅用以证明该细胞群有干细胞特性,不影响最终实验结果。2.2细胞一生物支架复合物取材、制备和植入：以脂肪颗粒和透明质酸为支架材料,和种子细胞混合制成细胞-生物支架复合物,本次实验共分5组：组①以ADSCs为种子细胞按25×106个/ml浓度与纯化后的脂肪颗粒1：1等体积混合配置成ADSCs+游离脂肪颗粒复合物；组②以单纯ADSCs为一组,将ADSCs配置成浓度为12.5×106个/ml悬液备用；组③以单纯纯化过的脂肪颗粒为一组；组④ADSCs按25×106个/ml浓度与医用透明质酸以1：1等体积混合；组⑤单纯透明质酸组；。按每组0.2ml注射至裸鼠(12只,5W雄性)背部皮下,形成5个点,每组各1个点,观察裸鼠植入后的生命体征及局部炎症反应情况,3个月后取材,用于检测与分析。将取材所获得的新生组织分别从体积、质量、组织学、mRNA表达、Ⅰ型胶原蛋白表达等方面进行研究。3结果本次试验12只裸鼠局部植入填充物后生命体征平稳,每只裸鼠注射部位均未见明显的炎症反应,组①、②、③、④均可见有新生组织形成,组⑤未见新生组织形成。大体观,组③、①可见明显有黄色脂肪颗粒型成,组②、④未见明显黄色脂肪脂肪颗粒,利用Masson三色染色染色法可见①、②、③、④四个组中均可见脂肪细胞,及胶原蛋白,其中ADSCs+游离脂肪颗粒组中富含胶原及脂肪颗粒,且脂肪颗粒及胶原结缔组织排列较规则,脂肪颗粒细胞大小不均匀,有新生脂肪颗粒细胞。单纯ADSCs移植入组可见大量的胶原形成,无明显成熟的脂肪颗粒细胞,排列紊乱,无明显规律。透明质酸--ADSCs组与单纯ADSCs组接近,富含胶原蛋白排列有序,未见明显成熟脂肪细胞,单纯游离脂肪颗粒移植入组可见大量脂肪细胞形成,排列规律,大小均匀,胶原蛋白形成相对较少。四组中体积组①组③组④组②,质量组①组③=组④组②,组③与组④之间质量差异无统计学意义。RT-PCR示四组中均见到人类mRNA表达,提示新生组织来自植入的复合组织。Western blot示四组中均可见Ⅰ型胶原蛋白表达,其含量有组②≈组④组①组③的趋势。 4结论 ADSCs其表面抗原较弱,不易产生抗原,不产生致热源,局部注射产生炎症反应较轻,注射局部无明显炎症反应。ADSCs可分泌内皮细胞生长因子促进局部血管形成,减少移植脂肪细胞缺血时间,降低游离脂肪颗粒移植后的吸收率,游离脂肪颗粒可以为ADSCs提供微环境促使其向成熟脂肪细胞分化；透明质酸可以为ADSCs提供生物支架,透明质酸+ADSCs复合生物材料植入宿主后可以构建新生组织,促进局部胶原蛋白分泌；单纯ADSCs可以促进局部胶原蛋白的分泌,可以形成新的软组织；单纯透明质酸凝胶局部注射不能形成新的软组织。
【关键词】：脂肪来源干细胞 组织工程技术 脂肪移植 胶原蛋白
【学位授予单位】：郑州大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2013
【分类号】：R318.08
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