滚压载荷生物反应器促进兔软骨细胞—丝素蛋白多孔支架复合体生成功能化关节软骨的研究

发布时间：2017-09-03 09:17

  本文关键词：滚压载荷生物反应器促进兔软骨细胞—丝素蛋白多孔支架复合体生成功能化关节软骨的研究

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【摘要】：软骨在人的日常生活中发挥着重要的作用,一旦软骨受到破坏人的日常活动会受到极大的影响。但软骨组织缺乏充足的血供和淋巴循环,其修复和再生能力有限。由关节炎和创伤导致的骨关节软骨损伤常常导致瘢痕愈合，最终导致关节功能的丧失，严重影响了人们的生活质量。在众多的治疗修复手段中，运用组织工程技术制造功能化的关节软骨成为最具有应用前景的方式。在工程化软骨的生成过程中，生物材料及力学作用对生成的软骨组织的结构及功能有重要的影响。丝素蛋白是一种天然蛋白，孔隙率高，对水及氧气有良好的渗透性，生物相容性很好，其促血凝作用很低，，细胞在其上的粘附增殖能力很强，可降解，具有良好的生物学弹性，在组织工程中得到大量的应用。在正常的关节运动中，关节软骨受到了多种力学作用，包括直接压缩力、静水压、流动剪切力等。研究也发现力学作用可以改善组织工程支架的力学性能。许多生物生物反应器被应用于软骨组织工程中。直接的动态压缩及流动剪切力可以增加软骨细胞支架的细胞增殖和基质合成含量，力学性能也得到很大的改善。仿生滚压载荷生物反应器最大程度的模拟生理状态下软骨组织的受力模式，对工程软骨进行直接压缩及流动剪切力作用。因此，本实验通过研究仿生力学的滚压加载生物反应器及丝素蛋白多孔支架的共同作用下对工程软骨的生成影响。 目的：观察仿生力学加载对丝素蛋白多孔支架-软骨细胞复合体生成工程软骨的影响。 方法：将2.5月龄新西兰兔的软骨组织在酶解法作用下分离出软骨细胞，培养至第3代后将软骨细胞接种于丝素蛋白多孔支架。将实验样本分为力学加载组和静态培养组。在接种后24小时后，对力学加载组施加10%压缩形变量0.33Hz2小时/天5天/周的仿生力学加载；静态对照组的培养条件和滚压加载组相同。分别在第3、7、14、21天时取各组样品行细胞活性检测，实时定量PCR，DAN、GAG和胶原含量检测以及组织学染色，观察细胞在滚压加载及静态培养支架上的存活、增殖、软骨特异性基因及蛋白的表达。 结果：丝素蛋白具有良好的生物相容性。细胞活性染色表明力学加载组和静态培养组丝素-软骨细胞支架中的死活细胞数目及细胞在支架中的存活率无差别。细胞接种后24小时，可见细胞均匀的分布于支架中，活细胞比大于96%。第7、14、21天时，力学加载组和静态培养组的活细胞比例差别不大，力学加载组90.26%±2.3%，静态培养组为89±1.2%。丝素蛋白-软骨细胞复合体在静态培养时，蛋白聚糖持续稳定表达；I型胶原、II型胶原的表达逐渐升高，分别在7天、14天时表达下调。丝素-软骨细胞培养物静态培养时，蛋白多糖及总胶原的表达也持续增高。 复合培养体在滚压加载后细胞的软骨特异性基因的表达较对照组明显升高（P＜0.05）。在第7、14天时滚压加载组的蛋白聚糖表达分别是静态组的1.623倍（P=0.04）、3.298倍（P=0.002）；但3、21天时，滚压加载组蛋白聚糖是静态组的0.72倍（P=0.26）、0.88倍（P=0.72），但无统计学差异。滚压组的II型胶原基因的表达也较静态培养组高（P＜0.05）。在3、7、14、21天时，滚压加载组的表达量分别是静态组的5.4倍（P＜0.01）、13.7倍（P＜0.01）、2.05倍（P=0.107）、4.51倍（P＜0.01）。I型胶原在滚压加载组出现短暂的表达上调，在第3天时，相对于静态组升高了2.95倍（P＜0.01）。在7天、14天、21天时，滚压加载的I型胶原表达是对照组的0.70倍（P=0.34）、1.26倍（P=0.47）、1.38倍（P=0.09），但无统计学差异。 滚压加载组的蛋白多糖及总胶原的表达量高于静态培养组（P＜0.05）。第3、7、14、21天时滚压加载组的蛋白多糖为12.17±1.835μg/(μgDAN)，17.367±2.48μg/(μg DAN)，25.83±1.56μg/(μg DAN)，30.25±3.41μg/(μg DAN),分别是静态组的分别是静态组的1.71倍（P=0.01），1.66倍（P=0.06），1.62倍（P＜0.01），1.76倍（P＜0.01）。第3、7、21天滚压组胶原是静态组的1.23倍（P=0.08）、0.73倍（P=0.17）、1.09倍（P=0.26），但无明显差异；在14天为1.52倍（P=0.045），表达高于静态组。但丝素-软骨细胞复合体合成的大量蛋白多糖流失入培养基中，复合培养物中的含量较低；在21天时滚压加载组支架中蛋白多糖保留率（10.5%）明显低于静态组（16.5%）（P＜0.05），支架中蛋白多糖含量无差异。组织染色表明蛋白多糖均匀分布于复合培养体中，但滚压组和静态对照组的蛋白多糖无明显差别，与生化检测结果一致。 结论：软骨细胞在丝素蛋白支架中具有良好的活性，在10%压缩幅度0.33Hz2小时/天5天/周的仿生滚压加载生物反应器作用下，丝素-软骨细胞复合物细胞软骨表型表达较好，细胞合成代谢旺盛，为工程软骨的再生提供合适的力学加载模式。
【关键词】：软骨细胞 生物反应器 仿生力学加载 丝素蛋白 组织工程
【学位授予单位】：河北医科大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2013
【分类号】：R318.08
【目录】：

• 中文摘要4-7
• 英文摘要7-11
• 研究论文 滚压载荷生物反应器促进兔软骨细胞-丝素蛋白多孔支架复合体生成功能化关节软骨的研究11
• 前言11-12
• 材料与方法12-20
• 结果20-23
• 附图23-31
• 附表31-33
• 讨论33-36
• 结论36
• 参考文献36-43
• 综述 静水压力促进工程软骨生成的研究进展43-54
• 参考文献49-54
• 致谢54-55
• 个人简历55

【共引文献】

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本文编号：784143