阿魏酸钠洗脱支架的制备及生物学性能研究

发布时间：2017-09-05 09:28

  本文关键词：阿魏酸钠洗脱支架的制备及生物学性能研究

  更多相关文章： 阿魏酸钠 内皮细胞 再狭窄 紫杉醇 药物释放动力学 生物可降解聚合物 支架

【摘要】：研究背景和目的： 缺血性脑血管疾病是高度致残致死性疾病，占脑血管疾病的75%-85%，30%-60%的缺血性脑血管病的发生可归因于颈动脉的狭窄，外科干预治疗颈动脉狭窄的主要措施包括颈动脉球囊扩张成形术，颈动脉支架植入术，颈动脉内膜剥脱术和搭桥手术。然而这些干预措施之后，再狭窄也随之发生，血管管腔直径逐渐减少，缺血症状再次出现，甚至导致血管闭塞。因此术后再狭窄的发生严重影响了手术的远期收益和疗效[1]，再狭窄的发生相当普遍，脑血管，冠脉血管，肾动脉，及其他外周血管术后均会出现不同程度的狭窄。新生内膜过度增生是球囊成形术后和支架植入术后再狭窄的主要病理特征[2]。新生内膜增殖是指血管平滑肌大量增殖并进入血管内膜或中层结构，它是血管内膜层受损后普遍存在的反应。新生内膜形成与许多因素有关。内皮损伤是其中一个关键因素[3]，光滑完整的内皮层能降低血栓和动脉粥样硬化的发生[4]，内皮细胞和平滑肌细胞密切相关，它调节着血管的收缩节律，并且通过一氧化氮、内皮素和前列腺素等途径调节着平滑肌的增殖。平滑肌细胞发生表型转换，分化型平滑肌细胞转变成分化程度较低的分泌型细胞（未分化或去分化型），其增殖和迁移能力增强，这是新生内膜形成的关键步骤之一[3]。 血管成形术是一种机械扩张狭窄或阻塞血管，使血管通畅的手术技术，病变血管狭窄和闭塞往往是由动脉粥样硬化而导致。血管成形术是一种微创手术，它通过球囊导管到达血管狭窄部位，充盈球囊压迫粥样硬化斑块，使斑块压缩至血管壁，然后回撤塌陷球囊，开放血管恢复血流。支架可以在球囊扩张的时候一并放入以维持血管开放状态。为降低再狭窄发生率，血管支架在不断改进，生物学性能也更加优秀。支架由最初的裸金属支架，演化出涂层支架，药物洗脱支架和可降解支架等。药物洗脱支架已成为心血管介入手术中应用较为广泛的植入器械。紫杉醇、雷帕霉素及其类似物被用于药物洗脱支架，有效抑制了平滑肌增殖，但是这些不可控、非特异的影响细胞周期的药物也明显抑制了血管内皮细胞的生长，阻止内皮重新愈合，导致晚期血栓形成和晚期支架内再狭窄[5-11]。许多其他药物也被试验性的用于涂层支架，，其目的是减少再狭窄和血栓的发生，可是效果并不理想。例如，皮质类固醇激素地塞米被用于治疗炎症、免疫疾病，还能抑制平滑肌细胞增殖[12]，但是临床研究显示地塞米松洗脱支架并不能有效抑制再狭窄。BENESTENT II试验对肝素涂层支架的抗再狭窄作用进行了评估，结果表明肝素涂层支架的促凝性明显降低，但是并没抑制新生内膜增生，对再狭窄没有改善[13]。由于支架植入术后病人需长期口服抗血小板药物，肝素涂层支架实际作用受到质疑。磷酸胆碱是细胞膜的主要成分，具有良好的血液相容性和组织相容性。将磷酸胆碱涂层支架植入实验动物（兔和猪）体内发现既没有促进新生内膜增生，也没有抑制再狭窄[14]。理想的药物涂层应能抑制平滑肌增生，同时促进内皮生长、愈合；完整光滑功能良好的内皮也是防止血栓形成的重要条件。因此，重视内皮功能恢复就有可能降低再狭窄率发生[15-17]，新的有效药物成为研究的热点，同时也是临床治疗的关键。 阿魏酸是一种源于植物的酚酸，它及其钠盐形式阿魏酸钠（sodium ferulate，SF）有多重生物学作用，包括抗肿瘤[18]，抗动脉粥样硬化[19,20]，抗血小板[21,22]，抗氧化，抗炎[23,24]。然而目前阿魏酸钠对内皮细胞作用的研究较少，其作用机制仍不清楚。本研究利用细胞培养和分子生物学技术观察、探讨了SF对脐静脉内皮细胞增殖和迁移的影响，为SF抗再狭窄作用的临床应用提供理论基础；然后将阿魏酸钠和4种多聚物载体相结合，用浸涂法制作阿魏酸钠多聚物涂层支架，在显微镜及电镜下观察自制涂层支架表面形态学，利用高效液相色谱技术测量药物缓释动力学，体外实验检测血液相容性，为动物体内实验打下基础。 方法： 培养人脐静脉内皮细胞，用不同浓度阿魏酸钠处理细胞，分为6组，对照组0μg/ml，0.1μg/ml，1μg/ml，10μg/ml，100μg/ml和1000μg/ml，在两个时间点，即处理24小时和48小时，用CCK-8试剂盒检测细胞活性。同样，采用划痕愈合试验观察不同药物浓度对细胞迁移能力的影响。采用免疫细胞化学和Western blot观察细胞内叉头蛋白M1（FoxM1）和血管内皮生长因子（VEGF）的表达。另一方面，用浸涂法制作阿魏酸钠多聚物涂层支架，显微镜和扫面电镜下观察阿魏酸钠多聚物涂层支架的表面形态；高效液相色谱测量自制涂层支架阿魏酸钠的释放量；通过溶血率、凝血酶原时间和活化部分凝血活酶时间实验，检测自制涂层支架血液相容性。 结果： 1.阿魏酸钠处理HUVECs24小时后，在10μg/ml和100μg/ml处理组，细胞活性与对照组相比明显提高；48小时后，细胞增殖趋势更加明显，在0.1-100μg/ml组细胞活性与对照组相比明显提高，然而在1000μg/ml处理组，细胞活性降低明显（P0.05）。 2.处理12小时，在1-100μg/ml组中，细胞迁移能力与对照组相比增强；处理24小时后，在0.1-100μg/ml组中，细胞迁移能力与对照组相比明显增强；处理48小时后，在0.1-100μg/ml组，细胞迁移能力与对照组相比增强，然而在1000μg/ml处理组中，细胞迁移能力明显受抑制（P0.05）。 3.药物处理12小时后，在1-100μg/ml组，细胞内FoxM1红色荧光的强度与对照相比明显增强，在0.1-100μg/ml组，HUVECs内VEGF红色荧光强度增强（P0.05）。 4.Western blot分析FoxM1和VEGF表达量的变化，研究发现，药物处理12和24小时后，在0.1-100μg/ml处理组，FoxM1的表达均较对照组显著提高；药物处理12小时，在10-100μg/ml处理组，VEGF中表达较对照组明显增强，处理24小时后，与对照组相比，VEGF的表达在0.1-100μg/ml处理组中均增强（P0.05）。 5.四种多聚物涂层支架（PLGA50，PLGA75，PDLLA和PLLA），涂层表面形态均一完整，较少出现多聚物聚集、桥接、开裂、剥脱等现象。4种涂层无明差异。 6. PLGA50和PLGA75支架组与PDLLA和PLLA相比，释放更为持续、良好。PLGA50和PLGA75释放量高于PDLLA和PLLA组。 7.裸支架组和4种多聚物涂层支架组（PLGA50，PLGA75，PDLLA和PLLA），溶血率均5%。四种多聚物涂层支架组PT和APTT与商品化金属裸支架组无明显差异。 结论： 阿魏酸钠促进内皮细胞的增殖和迁移，上调了FoxM1和VEGF的表达，呈剂量依赖性。阿魏酸钠促进内皮愈合、修复的这些特征可能使其成为一种抗再狭窄的药物或涂层药物。4种多聚物涂层支架表面形态学均匀完整，并具有良好的血液相容性。而PLGA50和PLGA75涂层支架组与PDLLA和PLLA组相比，可能具有更好的药物释放动力学。
【关键词】：阿魏酸钠 内皮细胞 再狭窄 紫杉醇 药物释放动力学 生物可降解聚合物 支架
【学位授予单位】：第四军医大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2014
【分类号】：R651.12;R318.08
【目录】：

• 缩略语表5-7
• 中文摘要7-11
• Abstract11-15
• 前言15-17
• 文献回顾17-26
• 第一部分 阿魏酸钠对人脐静脉内皮细胞作用的机制研究26-37
• 1 材料26-27
• 1.1 主要实验仪器26
• 1.2 主要试剂26-27
• 2 方法27-30
• 2.1 人脐静脉内皮细胞复苏及培养27-28
• 2.2 人脐静脉细胞处理及分组28
• 2.3 CCK-8 测阿魏酸钠对 HUVEC 增殖的影响28
• 2.4 划痕愈合试验检测阿魏酸钠对 HUVEC 迁移的影响28
• 2.5 免疫细胞化学分析细胞内 FoxM1 和 VEGF 的变化28-29
• 2.6 阿魏酸钠对 HUVECs 中 FoxM1 和 VEGF 蛋白表达的影响29-30
• 2.7 统计学处理30
• 3 结果30-34
• 3.1 阿魏酸钠对人脐静脉内皮细胞增殖的影响30-31
• 3.2 阿魏酸钠对内皮细胞迁移的影响31-32
• 3.3 阿魏酸钠对内皮细胞内 FoxM1 和 VEGF 表达的影响32-33
• 3.4 阿魏酸钠诱导人脐静脉内皮细胞 FoxM1 和 VEGF 表达33-34
• 4 讨论34-37
• 第二部分 阿魏酸钠涂层支架制备及血液相容性研究37-47
• 1 材料37-38
• 1.1 主要实验仪器37
• 1.2 主要试剂37-38
• 2 方法38-41
• 2.1 阿魏酸钠涂层支架的制作及分组38
• 2.2 阿魏酸钠涂层支架表面形态学检查38
• 2.3 涂层支架阿魏酸钠释放动力学检测38-39
• 2.4 阿魏酸钠涂层支架血液相容性检测39-40
• 2.5 统计学处理40-41
• 3 结果41-44
• 3.1 阿魏酸钠涂层支架表面形态学41-42
• 3.2 阿魏酸钠涂层支架药物释放动力学42-43
• 3.3 阿魏酸钠涂层支架血液相容性43-44
• 4 讨论44-47
• 小结47-48
• 参考文献48-58
• 研究成果58

【参考文献】

中国期刊全文数据库 前4条

1 赵克洪,沈江明;高龄老年患者颈动脉粥样硬化与心血管危险因素及缺血性脑卒中的相关规律[J];中国临床康复;2004年13期

2 任志强,刘丽君,龙艾兵,李宪为;高效液相色谱法测定血浆中阿魏酸钠含量[J];中国药房;2003年01期

3 喻红,洪嘉玲,吴东方;阿魏酸钠对氧化LDL所致兔主动脉平滑肌细胞增殖的影响[J];中国中药杂志;1999年06期

4 Serruys PW;Ormiston JA;Onuma Y;张瑞生;;生物可吸收依维莫司洗脱冠状动脉支架系统2年随访及多种成像法结果[J];中国心血管杂志;2009年02期

本文编号：797203