人脐带间充质干细胞与原代关节软骨细胞共培养修复山羊膝关节负重区全层软骨缺损
本文选题：hUCSCs + PACs ； 参考：《中国人民解放军医学院》2017年硕士论文
【摘要】：实验目的:理想的种子细胞是软骨组织工程中的核心要素,是实现软骨组织结构与功能性再生的必要前提,也是当前科学研究的重大热点之一。本实验的实验目的包括:1.结合临床需求及前期研究结果,以人脐带间充质干细胞(human umbilical cord-derived stem cells, hUCSCs)和原代软骨细胞(primary articular chondrocytes, pACs)作为种子细胞,脱细胞软骨细胞外基质(decellularized articular cartilage extracellular matrix, ACECM )取向支架作为载体,构建出 3D 共培养体;2.体外检测3D共培养体中种子细胞的生物学行为变化及组织学特性,评价共培养体所构建的组织工程软骨的功能特性;3.通过大动物山羊膝关节负重区全层软骨缺损体内修复实验,观察共培养体体内修复软骨损伤的潜能,综合评价共培养体在软骨损伤修复中的应用前景。实验方法:1.在无菌条件下从新鲜的山羊膝关节及人脐带中分离、培养山羊pACs和hUCSCs,并分别进行细胞表型鉴定,以猪源ACECM取向支架为共培养载体,两种种子细胞以不同比例混合(hUCSCs: pACs,分别为100:0、75:25、50:50、25:75、0:100)体外构建3D组织工程组织;2.体外共培养1周和3周,通过基因及蛋白表达水平、细胞学行为和组织学特性评价并比较各组共培养体组织工程组织的生物学特性;3.以成年山羊为实验对象,膝关节负重区股骨髁处造全层软骨缺损为实验模型,选择体外检测混合共培养比例较好的共培养组为实验组(co-culture group, CC),条件对照组为单纯ACECM取向支架组(ACECM group,AC)、微骨折组(microfracture group, MF)、ACECM 取向支架复合 hUCSCs(ACECM+hUCSCs group, ACUC)、ACECM 取向支架复合 pACs 组(ACECM+pACs, ACAC),空白对照组为单纯全层关节软骨损伤组(Blank Contorl group,BC),每组3只山羊。术后2周、4周分别抽取关节液涂片行HE染色,观察炎症反应。在术后6、9个月后分别用过量麻醉剂处死实验动物,取材参照国际软骨修复协会-软骨修复大体评分系统和软骨修复组织学评分系统对新生的关节软骨进行大体形态学及组织学观察及评分、人组织相容性I类抗原(HLA-ABC)观察修复区细胞的来源、软骨特异性基质成分定量检测(糖胺多糖)、影像学检测(7.0高分辨率核磁共振)及全膝关节影像学评分和生物力学检测(纳米压痕技术)综合系统评价并比较各组软骨修复效果。实验结果:1.分离获取的pACs及hUCSCs倒置显微镜下观察分别为类圆形和长梭形,免疫荧光检测显示pACs具有很好的软骨细胞特性,流式细胞技术与体外诱导成软骨实验得出hUCSCs具备干细胞的表征,并应用两种种子细胞以ACECM取向支架为载体,成功构建不同比例的共培养体;2.体外共培养1、3周后,大体观可见支架孔隙被细胞及细胞外基质不同程度的填充,死活染色可见各组细胞均生长良好,其中以100:0组细胞生长最快,0:100组细胞生长最慢,在细胞增殖检测方面,发现共培养后pACs的生长相对增快,而hUCSCs则表现为相对减缓,RT-PCR结果显示hUCSCs软骨相关基因(如collagenⅡ、aggrecan)表达水平上调,组织学染色(HE、番红“O”及免疫荧光)均可见共培养组分泌大量细胞外基质及软骨组织特异性细胞外基质成分,人组织相容性抗原免疫荧光染色显示在修复区呈现阳性,表明hUCSCsS存活并参与软骨损伤的修复过程,糖胺多糖定量检测表现为共培养组明显优于两种细胞分别单纯培养组,western-blot显示collagenⅡ与aggrecan蛋白表达总量在共培养组也较高,以50:50及25:75两组表达量更高,其中collagen Ⅰ在50:50组相对较低,均衡各检测指标以50:50组最具优势进入体内修复实验;3.关节液涂片HE染色结果显示,术后各实验组膝关节炎症反应与空白对照组相比未见明显差异。大体形态学观察及组织学染色结果均证实,实验组修复区再生的关节软骨更加接近天然软骨,且与周边整合良好,保持软骨下骨的完整性,获得更好的修复效果,生物力学检测表明实验组修复区组织力学强度较好,在9月结果中明显优于其他各组,糖胺多糖定量检测结果显示实验组新生组织含量明显高于其他各组,影像学结果(MRI)及评分可见实验组修复区软骨组织及软骨下骨信号与周围正常组织相似,T2W1抑脂像信号均匀,9月结果中软骨下骨水肿信号基本消失,关节腔关节液信号低。实验结论:分离培养出pACs和hUCSCs,以ACECM取向支架为载体在体外成功构建共培养体;不同比例的共培养体体外培养,获得了具有较好软骨组织特性的组织工程组织,hUCSCs被成功的天然诱导分化成软骨,同时增强了软骨细胞活性,促进了软骨细胞的增殖;大动物体内软骨修复实验,系统地验证了由hUCSCs和pACs共同构建的共培养体可成功修复全层关节软骨缺损,且新生组织特性更加接近天然软骨组织,同时保持了软骨下骨的完整性。结论,通过pACs和hUCSCs混合在ACECM取向支架中共培养,获得了具有较好软骨组织特性的组织工程软骨组织,实现了大动物体内损伤软骨的成功修复,一定程度上克服了干细胞机械性诱导分化带来的分化不足或软骨钙化等问题,以及软骨细胞体外扩增面临的去分化困境,因此hUCSCs和pACs共培养即克服了基础问题又符合临床需求,有望成为未来软骨组织修复与再生最具前景的策略之一。
[Abstract]:Objective : To study the biological behavior and histological characteristics of articular cartilage in vitro and to evaluate the potential of co - culture in the repair of cartilage damage . The results were as follows : 1 . After 6 and 9 months after operation , we observed the expression level up - regulation of human articular cartilage . Conclusion : The tissue engineering cartilage tissue with better cartilage tissue characteristics is obtained by mixing pACLS and hUCSCs in ACECM oriented scaffolds . The successful repair of cartilage in large animals has been achieved . Therefore , the co - culture of hUCSCs and pACDs can overcome the underlying problems and meet the clinical needs , which is expected to be one of the most promising strategies for future cartilage tissue repair and regeneration .
【学位授予单位】：中国人民解放军医学院
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2017
【分类号】：R681.3
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，本文编号：2092949
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