兔BDNF基因过表达和干扰慢病毒载体转染BMSCs与脊髓神经细胞共培养的实验研究

发布时间：2018-10-11 07:16

【摘要】：[目的]通过构建脑源性神经营养因子(Brain Derived Neurotrophic Factor, BDNF)基因过表达慢病毒载体,将BDNF载体转染骨髓基质干细胞(bone marrow stromal stem cells,BMSCs),观察与脊髓神经细胞共培养下,BDNF转染的BMSCs中过量表达产物对移植细胞BMSCs体外分化的影响,转染BDNF的BMSCs在体外能否对脊髓神经细胞具有保护作用,探讨转染BDNF的BMSCs体内实验的基础,研究细胞移植替代治疗及基因治疗脊髓疾病的新途径。[方法]一、兔骨髓基质干细胞分离、培养、鉴定1、BMSCs的原代培养、传代培养；2、流式细胞仪鉴定培养的BMSCs,进行CD29、CD34、CD45、CD90染色；二、兔BDNF基因过表达和干扰慢病毒载体构建及转染BMSCs1、从日本大耳兔脊髓中提取RNA,合成cDNA,构建BDNF基因过表达和干扰慢病毒载体并测序、酶切鉴定；2、采用定量PCR、Western blot实验进行BDNF过表达、干扰慢病毒载体最佳质粒筛选；3、BDNF过表达质粒及干扰质粒慢病毒包装,脂质体法转染BMSCs;4、RT-PCR、Western Blotting分别检测转染的BMSCs中BDNF基因、蛋白表达；三、兔BDNF基因慢病毒载体转染的BMSCs与脊髓神经细胞共培养1、兔脊髓神经细胞的提取、分离、原代培养；2、采用免疫组化法鉴定培养的兔脊髓神经细胞,进行NSE染色；3、共培养实验分为四组：A组：脊髓神经细胞与未转染的BMSCs培养；B组：脊髓神经细胞与转染BDNF过表达基因的BMSCs培养；C组：脊髓神经细胞与转染BDNF干扰基因的BMSCs培养；D组：脊髓神经细胞与转染空病毒载体的BMSCs培养。4、采用Transwell双层培养皿进行转染的BMSC细胞与脊髓神经细胞共培养；5、RT-PCR、Western Blotting分别检测共培养中BDNF基因、蛋白表达；6、采用免疫组化法鉴定共培养中向神经元样细胞分化的BMSCs,进行Nestin. NSE染色；四、结果检测采用SPSS17.0统计软件进行分析,所有数据均以x±s表示,数据组间差异用独立样本t检验分析,组内差异用单因素方差分析,P0.05具有统计学意义。[结果]1、BMSCs的培养、鉴定BMSCs原代培养后见贴壁生长的细胞数量逐渐增多,细胞形态变为长梭形,可见成纤维样细胞散布于培养瓶底,并有集落形成,细胞围绕中心呈漩涡状排列。细胞融合达80%时即可再次传代,BMSC细胞传至第3代时进行流式细胞仪鉴定,基本不表达造血干细胞的表面标志CD34、CD45,但CD29和CD90阳性。2、BDNF基因慢病毒载体构建、鉴定及最佳质粒筛选构建的慢病毒进行测序,以NCBI的基因进行比对,其所有基因均能100%匹配,酶切验证表达重组质粒,PCR验证干扰重组质粒,证实目的基因已插入重组质粒。QPCR、Western blot实验进行最佳质粒筛选,过表达组BDNF明显表达,干扰组BDNF明显减少,与对照组相比具有显著性统计学意义(p0.01)。3. BDNF基因慢病毒载体转染BMSCs及RT-PCR、Western Blotting检测免疫组化染色显示BDNF基因慢病毒载体成功转染BMSCs, RT-PCR、 Western Blotting检测基因、蛋白的表达显示干扰质粒BDNF表达最少,BDNF过表达基因转染的BMSCs中BDNF明显高于其他组(p0.01),差异有统计学意义。4、兔脊髓神经细胞的培养、鉴定脊髓神经细胞培养后细胞大部分贴壁,胞体增大,呈圆形或椭圆形,胞体周围的突起伸展并延长,形成单极、双极或多极突起。采用免疫组化法鉴定,培养3天的神经细胞经NSE免疫荧光染色,阳性率达86%以上。5、BDNF基因慢病毒载体转染的BMSCs与脊髓神经细胞共培养RT-PCR、Western Blotting分别检测共培养中转染的BMSCs BDNF基因、蛋白表达,C组BDNF mRNA及蛋白表达最少,B组BDNF mRNA及蛋白表达明显高于其他组,P0.05,差异有统计学意义。共培养后,B组大部分BMSCs向神经样细胞分化,而A、C、D组细胞形态变化较小。采用免疫组化法鉴定共培养中分化的BMSCs,定量计数分析B组表达NSE约为(89.49±1.25)%,Nestin约为(91.20±2.50)%,C组极少量表达NSE和Nestin, A组与D组少量表达NSE和Nestin。B组、C组与A组比较P0.05,差异有统计学意义；D组与A组比较P0.05,无明显差异。[结论]1、BMSC可以在体外分离、培养、传代、扩增,经流式细胞仪鉴定证实分离培养的细胞为BMSC。2、兔BDNF基因过表达慢病毒载体构建成功,成功转染BMSCs,有效增强BMSCs中BDNF基因的表达,能够稳定表达BDNF蛋白。3、与脊髓神经细胞共培养下,BDNF基因过表达慢病毒载体转染的BMSCs高表达BDNF mRNA,在BMSCs分泌物中BDNF蛋白分泌较多,促进共培养的BMSCs向神经元样细胞分化,促进其突起的形成和生长,对脊髓神经细胞有保护作用。
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【学位授予单位】：昆明医科大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2016
【分类号】：R651.2

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