慢病毒介导Pannexin3基因促进大鼠骨髓间充质干细胞成软骨分化

发布时间：2017-03-29 08:11

  本文关键词：慢病毒介导Pannexin3基因促进大鼠骨髓间充质干细胞成软骨分化，由笔耕文化传播整理发布。

【摘要】：目的:通过对大鼠骨髓间充质干细胞(Bone Marrow Stem Cells,BMSCs)进行慢病毒转染Pannexin3基因进而研究Pannexin3对成软骨分化的影响。方法:通过提取大鼠股骨、胫骨骨髓,用贴壁培养法体外培养大鼠BMSCs,传至第三代,对其进行成软骨诱导,Western Blot检测0d.3d.7d.14d.21d Pannexin3表达情况。再次体外培养大鼠BMSCs,传至第三代,并按照以下情况分组:空白对照组:不作处理;空载体(Mock)转染组:转染带有Mock阴性基因的慢病毒;Pannexin3转染(Panx3)组:转染携带Pannexin3基因的慢病毒;转染48h后荧光显微镜观察Panx3组和Mock组的荧光表达,并评估转染效率;三组均用成软骨诱导液进行诱导培养;倒置相差显微镜下观察体外培养的BMSCs和诱导后各组细胞的生长情况;MTT法绘制各组细胞诱导后0h.24h.48h.72h时生长曲线;培养至第14天,予以甲苯胺蓝染色对诱导后的细胞进行鉴定;RT-PCR检测软骨特异性标记物II型胶原(Collagen-type II,COL II)、聚集蛋白聚糖(Aggrecan)m RNA的表达;Western Blot检测各组细胞Pannexin3及β-catenin的表达情况;实验数据采用均数±标准差(x±S)表示,应用SPSS 19.0统计软件进行数据分析,组间及两两参数比较用单因素方差分析,方差整齐时两两比较行LSD检验,方差不齐时行Tamhane检验,当P0.05时认为有统计学意义。结果:1.倒置相差显微镜下观察BMSCs体外培养生长状况:静置培养48h后有少量细胞贴壁,96h后可见细胞部分细胞形态为长梭形,并呈由中央向四周放射,第三代BMSCs培养至第4天可铺满90%左右,呈螺旋状排列,细胞形态均匀,呈长梭形;2.Western Blot结果显示大鼠BMSCs成软骨诱导过程中,随着诱导时间的增加,Pannexin3表达量逐渐上升,于14天达高峰,21天表达下调;3.倒置相差显微镜下观察BMSCs成软骨诱导后的形态变化及生长情况:于诱导后48h可见所有细胞存在收缩现象,细胞数量不变,细胞长度变短,随着诱导时间的增加,培养板中所有细胞逐渐收缩变为椭圆形,部分细胞脱壁死亡,剩余细胞存在明显聚集现象;4.荧光显微镜下观察Panx3组及Mock组转染呈现出显著的绿色荧光,转染效率约为85%;5.MTT结果显示随着时间的增加,三组细胞均有增殖,24h时Panx3组BMSCs吸光值即小于对照组及Mock组(P0.05),48h及72h时Panx3组吸光值明显小于对照组及空载体转染组(P0.05);6.在三组BMSCs成软骨诱导14d后,对照组、Mock组、Panx3组甲苯胺蓝染色均呈现阳性;7.RT-PCR显示成软骨诱导后14d Panx3组软骨特异性标记物II型胶原(Collagen-type II,COL II)、聚集蛋白聚糖(Aggrecan)m RNA的表达较对照组及空载体转染组高(P0.05);8.Western Blot显示成软骨诱导后14天Panx3组Pannexin3的表达高于对照组及Mock组(P0.05),而β-catenin表达明显低于另外两组(P0.05)。结论:1.大鼠骨髓间充质干细胞成软骨分化过程中,Pannexin3的表达在3d时即有增加,7d时即有明显增加,14d时达高峰,Pannexin3在BMSCs成软骨分化中起重要作用;2.携带Pannexin3基因的慢病毒在成功感染BMSCs后对细胞的增殖起到了抑制作用;3.Pannexin3能够促进软骨分化;4.Pannexin3促进软骨分化的方式可能与Wnt/β-catenin通路的失活有关。
【关键词】：骨髓间充质干细胞 软骨分化 缝隙连接蛋白 泛连接蛋白 Wnt/β-catenin信号通路
【学位授予单位】：遵义医学院
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2016
【分类号】：R68
【目录】：

• 中英文缩略词对照表4-5
• 中文摘要5-7
• 英文摘要7-9
• 前言9-12
• 材料12-15
• 实验方法15-22
• 结果22-31
• 讨论31-35
• 结论35-36
• 参考文献36-40
• 综述40-50
• 参考文献46-50
• 致谢50-51
• 作者简介51

【参考文献】

中国期刊全文数据库 前4条

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本文编号：274003