大麻素Ⅱ型受体调节阿尔茨海默病样小鼠学习记忆能力的神经源性炎症机制研究

发布时间：2017-04-06 21:21

  本文关键词：大麻素Ⅱ型受体调节阿尔茨海默病样小鼠学习记忆能力的神经源性炎症机制研究，，由笔耕文化传播整理发布。

【摘要】：目的:以大麻素Ⅱ型受体(cannabinoid receptor 2,CB2R)激动剂和CB2R基因敲除小鼠(CB2R knockout mice,CB2RKO)为工具,正反两方面研究CB2R对阿尔茨海默病(Alzheimer's disease,AD)模型小鼠中β-淀粉样蛋白(β-amyloid,Aβ)诱导的神经源性炎症和学习记忆能力的调节作用及可能机制,为CB2R成为AD等神经退行性疾病抗炎治疗新型药物候选靶标提供更多的理论依据。方法:1行为学实验分别选取6、8月龄APP/PS1转基因AD模型小鼠(发病早、中期)开始接受连续8周选择性CB2R激动剂JWH-015处理(腹腔注射,0.5mg/kg/天);于8、10月龄时通过新奇物体识别实验、Morris水迷宫来评价JWH-015处理对APP/PS1小鼠非空间和空间学习记忆能力的影响;利用CB2RKO小鼠建立Aβ1-42双侧海马CA1脑区注射AD模型(CB2RKO小鼠AD模型)研究JWH-015调节学习记忆能力作用与CB2R之间的特异性关系以及CB2R缺失对AD模型小鼠非空间学习记忆能力的影响。2 Aβ病理性沉积行为学实验结束后,通过刚果红染色观察JWH-015处理对8、10月龄APP/PS1小鼠皮层、海马脑区Aβ斑块沉积数目的影响。3胶质细胞免疫反应性通过免疫荧光实验检测JWH-015处理和CB2R缺失对AD模型小鼠皮层、海马脑区内小胶质细胞标志物离子型钙结合受体分子1(ionized calcium-binding receptor adapter molecular 1,Iba1)和星形胶质细胞标志物胶质纤维酸性蛋白(glial fibrillary acidic protein,GFAP)免疫荧光强度的影响。4小胶质细胞功能表型通过实时定量PCR技术检测JWH-015处理和CB2R缺失对AD模型小鼠前额叶皮层(prefrontal cortex,PFC)和海马脑区内M1型小胶质细胞标志物白细胞介素6(interleukin 6,IL-6)、肿瘤坏死因子-α(tumor necrosis factor-α,TNF-α)、诱导性一氧化氮合酶(inducible nitric oxide synthase,i NOS),M2型小胶质细胞标志物几丁质酶3样蛋白(chitinase-3 like protein,Ym1/2)以及CB2R m RNA表达的影响。5神经元树突复杂性通过高尔基染色技术观察JWH-015处理对8、10月龄APP/PS1小鼠PFC和海马齿状回(denate gyrus,DG)脑区内锥体神经元树突长度、分枝节点数和棘突密度的影响。6神经干细胞增殖能力将5-溴脱氧尿嘧啶核苷(5-bromodeoxyuridine,Brd U)腹腔注射掺入处于增殖期的神经干细细胞后,通过免疫组化实验检测JWH-015处理对8、10月龄APP/PS1小鼠海马DG区Brd U染色阳性细胞数目的影响。结果:1 CB2R与非空间学习记忆能力与同龄野生型对照组相比,8、10月龄APP/PS1模型组小鼠新奇物体识别指数均显著降低(P0.001和P0.05),提示8、10月龄APP/PS1小鼠非空间学习记忆能力明显受损;与同龄APP/PS1模型组相比,8、10月龄APP/PS1+JWH-015处理组小鼠新奇物体识别指数均显著提高(P0.001和P0.05),提示JWH-015处理能够显著改善AD模型小鼠非空间学习记忆能力。为了研究JWH-015上述促认知能力作用与CB2R之间的特异性关系以及CB2R缺失对AD模型非空间学习能力损伤的影响,我们在CB2RKO小鼠AD模型上进行了新奇物体识别实验。研究发现,与CB2RKO小鼠空白对照组相比,CB2RKO小鼠AD模型组的新奇物体识别指数也显著降低(P0.05),并且JWH-015处理对其新奇物体识别指数无显著性影响,提示JWH-015特异性作用于CB2R提高AD模型小鼠PFC脑区依赖的非空间学习记忆能力。与WT小鼠AD模型组相比,CB2RKO小鼠AD模型组新奇物体识别指数显著下降(P0.05),提示CB2R缺失加重AD模型小鼠非空间学习记忆能力损伤。以上研究表明,CB2R在AD模型的非空间学习记忆能力方面发挥重要调节作用。CB2R与空间学习记忆能力与同龄野生型对照组相比,8、10月龄APP/PS1模型组小鼠第5天上台潜伏期均显著延长(P0.05和P0.05)、第6天穿台次数均显著减少(P0.05和P0.05),提示AD模型小鼠空间学习记忆能力明显受损;与同龄APP/PS1模型组相比,8月龄APP/PS1+JWH-015处理组小鼠上台潜伏期显著缩短(P0.05),而10月龄APP/PS1+JWH-015处理组小鼠上台潜伏期和穿台次数均未见显著改变,提示JWH-015激动CB2R对发病早期APP/PS1小鼠海马依赖的空间学习记忆能力作用要强于发病中期。行为学实验研究表明,CB2R对AD模型小鼠的PFC脑区依赖的非空间学习记忆能力的调节作用要强于海马脑区依赖的空间学习记忆能力。为了研究CB2R对AD模型小鼠学习记忆能力调节作用是否与脑内Aβ相关病理改变有关,我们开展如下机制探索。2 CB2R与Aβ病理性沉积与同龄野生型对照组相比,8、10月龄APP/PS1模型组小鼠皮层、海马脑区均出现刚果红染色阳性的Aβ斑块,且数目随月龄增加而增多;与同龄APP/PS1模型组相比,8、10月龄APP/PS1+JWH-015处理组小鼠皮层、海马脑区Aβ斑数目均未见显著变化,提示JWH-015激动CB2R对AD模型小鼠脑内Aβ斑块病理性沉积无影响。3 CB2R与胶质细胞免疫反应性与同龄野生型对照组相比,8、10月龄APP/PS1模型组小鼠皮层、海马脑区内Iba1、GFAP免疫荧光强度均显著增强(P0.05);与同龄APP/PS1模型组相比,8、10月龄APP/PS1+JWH-015处理组小鼠皮层脑区Iba1免疫荧光强度显著下降(P0.05和P0.01),而海马脑区Iba1和皮层、海马脑区GFAP的免疫荧光强度均无显著性影响,提示JWH-015处理能够脑区特异性地降低小胶质细胞的免疫反应性。而为了研究JWH-015对小胶质细胞的免疫调节作用与CB2R之间的特异性关系并研究CB2R缺失对小胶质细胞免疫反应性的影响,我们在CB2RKO小鼠AD模型上检测了小胶质细胞标志物Iba1的免疫荧光强度。研究发现,与CB2RKO空白对照组相比,CB2RKO小鼠AD模型组的Iba1免疫荧光强度显著增强(P0.05),且JWH-015处理对其Iba1免疫荧光强度无显著性影响,提示JWH-015特异性作用于CB2R调节小胶质细胞的免疫反应性。同时,与WT小鼠AD模型组相比,CB2RKO小鼠AD模型组Iba1免疫荧光强度有增强的趋势,且小胶质细胞激活形态明显改变:胞体增大,分枝粗短而密集。此外,Aβ1-42双侧海马CA1区注射AD模型小鼠各处理组间GFAP免疫荧光强度未见显著差异,提示AD模型小鼠的行为学改变可能并不依赖于星形胶质细胞的免疫反应性。免疫荧光实验结果表明,CB2R对AD模型小鼠不同功能脑区内小胶质细胞的免疫反应性和激活形态发挥重要调节作用。为了验证小胶质细胞激活形态的差异是否引起功能作用的转变,我们进行了小胶质细胞功能表型的研究。4 CB2R与小胶质细胞功能表型与同龄野生型对照组相比,8、10月龄APP/PS1模型组小鼠PFC、海马脑区内M1型小胶质细胞标志物IL-6、TNF-αm RNA表达水平不同程度地上调,提示AD模型小鼠脑内促炎型小胶质细胞表达增高;与同龄APP/PS1模型组相比,8、10月龄APP/PS1+JWH-015处理组小鼠PFC、海马脑区IL-6、TNF-αm RNA表达不同程度地下调,M2型小胶质细胞标志物Ym1/2 m RNA表达水平显著上调(P0.05),且JWH-015在PFC脑区上述作用程度较海马脑区显著,提示JWH-015激动CB2R能够促进AD模型小鼠不同功能脑区内小胶质细胞的功能表型转化。而为了研究JWH-015调节小胶质细胞功能表型的作用与CB2R之间的特异性关系并研究CB2R缺失对小胶质细胞功能表型的影响,我们在CB2RKO小鼠AD模型上检测了M1/M2型小胶质细胞标志物m RNA表达水平。研究发现,与CB2RKO小鼠空白对照组相比,CB2RKO小鼠AD模型组PFC脑区内IL-6、TNF-α、i NOS m RNA表达水平显著增高(P0.001、P0.01和P=0.0507),且Ym1/2 m RNA表达水平显著降低(P0.05),同时JWH-015处理对其IL-6、TNF-α、i NOS和Ym1/2 m RNA表达水平无显著性影响,提示JWH-015特异性作用于CB2R调节小胶质细胞功能表型的转化。而与WT小鼠AD模型组相比,CB2RKO小鼠AD模型组PFC脑区内IL-6、TNF-αm RNA表达水平均显著增加(P0.01和P0.05),提示CB2R缺失显著增强AD模型小鼠M1型小胶质细胞表达。此外,与同龄野生型对照组相比,8、10月龄APP/PS1模型小鼠PFC、海马脑区内CB2R m RNA表达水平均显著升高(P0.05),但JWH-015处理对CB2R m RNA表达水平无显著影响。上述研究结果表明,CB2R在AD模型小鼠不同功能脑区内小胶质细胞的免疫反应性、激活形态和功能表型转化方面发挥重要调节作用,并与其在认知能力方面的改善作用关系密切。5 CB2R与神经元树突复杂性与同龄野生型对照组相比,8、10月龄APP/PS1模型组小鼠PFC脑区锥体神经元的树突长度、分枝节点数、棘突密度和DG脑区锥体神经元棘突密度均显著下降(P0.001),提示AD模型小鼠不同功能脑区内神经元树突复杂性的下降可能与其认知能力损伤有关。与同龄APP/PS1模型组相比,8、10月龄APP/PS1+JWH-015处理组小鼠PFC脑区锥体神经元树突长度、树突分枝节点数以及棘突密度均显著性增加(P0.001),DG区神经元棘突密度无显著性影响,提示JWH-015激动CB2R能够脑区依赖性地改善AD模型小鼠神经元树突复杂性,这可能是与CB2R在不同功能脑区的炎性调节作用有关,但目前研究结果无法确定两者的关系。6 CB2R与神经干细胞增殖能力与同龄野生型对照组相比,8月龄APP/PS1模型组小鼠海马DG区Brd U阳性细胞数目无显著性变化,而10月龄APP/PS1模型组小鼠则显著减少(P0.01),提示发病中期AD模型小鼠出现神经干细胞增殖能力下降。与同龄APP/PS1模型组相比,10月龄APP/PS1+JWH-015处理组小鼠海马DG区Brd U阳性细胞数显著增加(P0.05),提示JWH-015激动CB2R能够显著增强APP/PS1小鼠海马脑区神经干细胞增殖能力,可能与CB2R调节海马脑区炎性微环境的作用有关,但缺少直接的实验证据,需要进一步研究。结论:特异性激动CB2R能够显著提高AD模型小鼠非空间学习记忆能力,其机制可能与脑区特异性地调节小胶质细胞介导的神经源性炎症,改善神经干细胞增殖能力和树突复杂性有关;CB2R缺失会明显改变AD模型小鼠脑内小胶质细胞激活形态和功能表型,加重非空间学习记忆损伤。因此,CB2R在AD病程进展中的神经源性炎症和学习记忆能力方面发挥重要调节作用,有希望成为AD抗炎治疗的新型候选药物靶点。
【关键词】：大麻素Ⅱ型受体 阿尔茨海默病 小胶质细胞 神经源性炎症 神经可塑性 学习记忆能力
【学位授予单位】：河北医科大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2016
【分类号】：R614
【目录】：

• 中文摘要4-9
• 英文摘要9-15
• 英文缩写15-16
• 前言16-19
• 材料与方法19-29
• 结果29-37
• 附图37-50
• 附表50-51
• 讨论51-61
• 结论61-62
• 参考文献62-69
• 综述 大麻素系统在阿尔茨海默病神经源性炎症中的调节作用69-88
• 参考文献78-88
• 致谢88-90
• 个人简历90

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本文编号：289713