新型可注射、可降解、抗骨质疏松多功能骨水泥的体内外研究

发布时间：2017-06-12 18:03

  本文关键词：新型可注射、可降解、抗骨质疏松多功能骨水泥的体内外研究，由笔耕文化传播整理发布。

【摘要】：背景骨质疏松性骨折常发生胸腰椎椎体、老年髋部或桡骨远端骨质等,骨质疏松性骨折的风险跟年龄有很大的相关性,所以中国社会骨质疏松相关性骨折的患病率将随我国日益加重的老年化而变得越来越严重。辛伐他汀(simvastatin,SIM)不仅具有调脂作用,文献报道还具有抗骨质疏松作用,但其抗骨质疏松效益还没充分挖掘出来,口服SIM需经肝肾代谢,患者长期服用不方便依从性差,而且到达骨组织的药物较少,不能达到药物最低有效浓度,因此,找寻一种合适的药物载体,改变骨科相关疾病的单一给药方式,成为了目前国内外学者研究的一个热点。磷酸钙骨水泥(calcium phosphate cement,CPC)因其自固化、可降解、不产热、具有骨传导性及良好的组织相容性等优点被用于骨质疏松性椎体压缩骨折的治疗,然而其降解速度慢及无抗骨质疏松作用限制了其临床应用。通过聚左旋乳酸(Poly-L-lactic acid,PLLA)制作载药微球后与CPC混合,能更好的控制药物的缓释,实现SIM的靶向缓释治疗,能大大提高SIM的生物利用率,增强CPC在骨质疏松性骨折的功效,在骨质疏松性脊柱压缩性骨折中实现材料降解与骨生成率匹配及抗骨质疏松功效,实现骨质疏松椎体压缩性骨折的生理性愈合,拓宽了CPC材料的应用途径。本实验对SIM-PLLA-CPC多功能骨水泥进行材料学研究细胞学研究及兔骨质疏松模型在体实验,在体动物实验抗骨质疏松分析,为进一步的临床研究提供基础数据支持,为临床应用打下基础。目的通过将SIM-PLLA载药微球与CPC混合,优化最佳材料复合比,构建一种新型SIM-PLLA-CPC多功能骨水泥材料,并通过材料学研究、细胞学实验及动物在体实验等方面对多功能骨水泥材料进行评估,为骨质疏松椎体压缩骨折的临床治疗提供又一选择。方法1、SIM-PLLA微球的制备：通过快速膜乳化法制备微球；2、多功能骨水泥的制备：分别制备含载药PLLA微球质量分数为0%、5%和10%磷酸钙骨水泥粉末：分别为对照组(单纯CPC组)、SIM-PLLA-CPC(?)剂量组及SIM-PLLA-CPC高剂量组,用物理共混的方法载药SIM-PLLA微球与CPC固相粉剂混合,对照组不加入载药微球,获得多功能骨水泥粉剂；3、通过SEM观察SIM-PLLA微球的表征；4、SIM-PLLA微球的包封率及载药率测量：取微球溶解进行紫外测量,计算微球中的药物质量。计算包封率和载药率。5、复合骨水泥的理化性质：测定材料的可注射性、凝固时间、力学强度、X线衍射分析及体外降解率。6、SIM-PLLA微球体外药物释放规律检测称量微球到透析袋放入PBS溶液中,在37℃下释放；观察药物释放情况。7、多功能骨水泥细胞学实验：把刚出生的SD大鼠取颅骨用组织块培养法培养成骨细胞,接种于材料试样表面共培养一定时间后,进行电镜观察细胞在材料表面的粘附情况,用CCK8方法检测复合材料对成骨细胞粘附及增殖的影响,应用ALP试剂盒检测材料对成骨细胞分化的影响。8、骨质疏松模型的构建按张X等的方法建立兔骨质疏松模型,即去势+地塞米松处理的方法。9、动物分组及动物在体实验：将造模成功的新西兰大耳白兔,随机分为3组,即CPC组,SIM-PLLA-CPC低剂量组和SIM-PLLA-CPC高剂量组。取兔子股骨髁外侧切口,用电钻开出圆柱状骨缺损,植入骨水泥材料。10、Micro-CT分析：在术后4、12周两个时间点每组分别随机处死6只兔子,把股骨远端分离,Micro-CT扫描,通过分析软件得出标本中剩余材料的体积比(RMVF)和新骨长入的体积分数(BVF)以及材料周围骨小梁的立体测量学指标,如骨小梁的厚度、数量及密度等。结果1、SEM下可见微球均匀球状结构,分散性好,微球间无黏连。粒径大小均匀,表面较多褶皱。2、SIM-PLLA微球的包封率及载药率测量：计算得到SIM-PLLA微球的载药率是9.3%,包封率是36.1%。3、体外复合材料理化性质测定：3.1、可注射性能、凝固时间及力学强度检测：注射性：前4min时,单纯CPC组和含PLLA微球组的注射性能无明显差异,8min后,含PLLA微球组可注射性均大于单纯CPC组比较,注射性有所改善,未见复合骨水泥材料出现固液分离现象,三组材料间比较差异有统计学意义(P0.05),而含微球组高低剂量组间的比较无统计学差异(P0.05)。凝固时间：CPC组和两个含PLLA微球组比较,微球组凝固时间延长,但差异无统计学意义(P0.05)。力学强度：可见,各材料组力学强度在1d、7d时间点,各组间比较无统计学差异(P0.05)。3.2 X射线衍射分析(XRD)：单纯CPC组和SIM-PLLA-CPC组样品的XRD谱线与标准羟基磷灰石谱线相同,两组材料XRD主峰位于30°附近,没有发现其它衍射峰。3.3、复合SIM-PLLA骨水泥材料表征SEM结果见复合材料表面较为致密,在放大1000倍条件下,局部可见70～80μm大小的孔径,表面可见较多结晶体,可见部分微球分布,在5000倍放大条件下,可见较多褶皱微球嵌入材料里面,均匀的在材料间分布,微球结构保持完整视野中微球粒径大小在1～3μn左右。4、药物释放检测：由图3可见,药物缓释观察时间周期25天,SIM-PLLA微球在前5天时间里有明显的突释现象,第10天后,释放率达51.25±4.35%,10天以后SIM-PLLA微球药物缓释平稳,直到25天时达到69.75±4.79%。5、CPC和SIM-PLLA-CPC材料表面成骨细胞黏附实验在培养4h后,各组的粘附性均无差异(P0.05),随着培养时间的延长,低、高剂量SIM-PLLA-CPC组细胞的黏附性提高,并与单纯CPC比较有统计学差异P0.05,高剂量SIM-PLLA-CPC组OD值比低剂量组高,但其差异无统计学意义P0.05,细胞在材料表面培养12h后,低、高剂量SIM-PLLA-CPC组黏附性指标更高,与单纯CPC材料比较有统计学差异P0.05。6、CPC和SIM-PLLA-CPC材料表面成骨细胞增殖实验：在1、3、5、7天时CCK-8方法所测得的吸光度值,在第1天时,低、高剂量SIM-PLLA-CPC组比单纯CPC组OD值更高,但只有高剂量组与单纯CPC组比较有统计学差异P0.05,培养的第3天,两组SIM-PLLA-CPC均比CPC高且有统计学意义,OD值随SIM-PLLA-CPC微球含量的增高而增高,说明载药微球对细胞无毒副作用,生物相容性好,并表现出与SIM剂量相关的活性。7、CPC和SIM-PLLA-CPC材料表面成骨细胞分化实验：单纯CPC和低、高剂量SIM-PLLA-CPC材料表面接种细胞后7天检测ALP活性结果,可见含高剂量SIM组ALP活性比单纯CPC和低剂量组高,其差异有统计学意义P0.05,低剂量SIM-PLLA-CPC酶活性比单纯CPC的高,但无统计学差异P0.05。8、Micro-CT分析结果：单纯CPC组RMVF从4w的91.6±0.13%到12w的84.32±2.03,而高剂量材料组从4w的84.5±0.73%到12w时的75.6±2.11%,说明高剂量组材料的降解速度明显快于单纯CPC组(P0.05),而低剂量组材料降解速度介于单纯CPC和高剂量组之间(P0.05),说明不同剂量载药微球对材料降解速度有剂量相关性。新骨长入的体积分数(BVF),各组材料均有随时间推移,新骨生成率增加的趋势,其中高剂量SIM-PLLA-CPC组新骨生成速度最快,在12w时达到了17.8±1.49%,远大于单纯CPC的9.72±0.75%(P0.05)。而低剂量组材料中新骨生长速度介于单纯CPC和高剂量组之间(P0.05),并且低剂量组和高剂量组间比较有统计学差异(P0.05),说明不同剂量载药微球对材料促进骨生长速度有剂量相关性。Micro-CT三维重建图及截面重建图：可见三组材料均出现随4w、12w时间推移材料进一步降解,新生骨逐渐长入的情况。单纯CPC组材料三维重建及横截面4w与12w的影像图无明显改变,低剂量SIM-PLLA-CPC组12w的材料与4w比较,材料随时间推移降解明显,4w时可见新生骨呈星点状生长,12w时复合材料进一步降解,材料降解出来的空间有新骨长入内部。高剂量组与低剂量组材料比较,上述随时间变化的趋势更加明显,三维重建可见材料12w时已经呈疏松多孔结构,可见高剂量组材料周边与骨组织切合紧密,新生成的骨组织由周边往材料深面生长,新骨长入范围也更广。植入材料术后4w时材料周围的骨小梁参数,可以看出各组差异不显著P0.05,仅仅高剂量SIM-PLLA-CPC组骨小梁数量1.95±0.18 mm-1,高于其它两组P0.05；表X2显示12周时情况,12w时高剂量组(BV/TV)、Tb.N、Tb.Sp均比单纯CPC组有改善(P0.05),12w时CPC组各参数BV/TV、Tb.N还比4w时指标下降了,但无统计学差异(P0.05)。而高剂量组各指标均比4w时有所改善。结论1)通过快速膜乳化法成制作载药微球SIM-PLLA,粒径大小为(1.63±0.54)μm,表面褶皱,球型饱满。2)复合SIM-PLLA微球的SIM-PLLA-CPC材料表面较为紧密,SIM-PLLA微球均匀分布在材料内部,XRD反映材料结晶仍主要为羟基磷灰石,表面SIM-PLLA微球对自固化过程无明显干扰,复合材料在注射性能、凝固时间、力学性能等方面无明显差异；3)体外缓释方面,药物缓释观察时间周期25天,SIM-PLLA微球在前5天时间里有明显的突释现象,第10天后,释放率达51.25±4.35%,10天以后SIM-PLLA微球药物缓释平稳,直到25天时达到69.75±4.79%。4)SIM-PLLA-CPC复合材料可促进成骨细胞黏附、增殖及分化,有一定的剂量相关性,体外细胞实验也证实复合材料也有与单纯CPC或PLLA材料相媲美的生物相容性,并且具有更强的促骨代谢作用。5)SIM-PLLA-CPC复合材料1个月的体外PH值变化稳定,与单纯CPC组比较无差异,说明PLLA与CPC复合可抑制PLLA降解产酸造成的PH值明显降低效应。6)SIM-PLLA-CPC复合材料在骨质疏松兔股骨髁缺损部具有合适的力学强度、中后期更高的材料降解率及新骨生成率；7)SIM-PLLA-CPC复合材料在骨质疏松兔模型中具有改善局部骨质的效果,可实现即时力学支撑和局部抗骨质疏松相结合；综上所述,本实验通过将SIM-PLLA微球与CPC骨水泥复合构建的SIM-PLLA-CPC复合骨水泥材料具有良好的生物相容性好、可注射性能及合适的力学强度,对兔骨质疏松模型有明显的成骨活性及抗骨质疏松效果,有望成为治疗骨质疏松性椎体压缩骨折的及不规则骨缺损的新型生物复合材料。
【关键词】：骨质疏松 磷酸钙骨水泥 成骨细胞 Micro-CT 辛伐他汀
【学位授予单位】：南方医科大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2016
【分类号】：R687
【目录】：

• 摘要3-9
• ABSTRACT9-20
• 前言20-33
• 参考文献27-33
• 第一章 负载辛伐他汀微球的磷酸钙骨水泥的构建及性能检测33-60
• 1 材料与方法34-40
• 2 结果40-50
• 3 讨论50-53
• 4 结论53-55
• 5 参考文献55-60
• 第二章 负载辛伐他汀微球的磷酸钙骨水泥在体内抗骨质疏松研究60-73
• 1 材料与方法60-62
• 2 结果62-68
• 3 讨论68-70
• 4 结论70
• 5 参考文献70-73
• 全文小结73-74
• 中英文对照缩略词表74-75
• 攻读学位期间成果75-76
• 致谢76-78

【相似文献】

中国期刊全文数据库 前10条

1 ;A New Route for Preparation of β-TCP/ PLLA Composite[J];Chinese Chemical Letters;2006年06期

2 林强;陈海云;李皓莘;蔡杨庭;;Preparation of PLLA/bpV(pic) Microspheres and Their Effect on Nerve Cells[J];Journal of Huazhong University of Science and Technology(Medical Sciences);2014年01期

3 毛屹;董寅生;林萍华;储成林;盛晓波;郭超;;PLLA/HA复合微球的制备[J];化工新型材料;2010年07期

4 葛骏;李志兵;高jK功;;可生物降解高分子PLLA/PHB混合薄膜结晶性的研究[J];中山大学学报(自然科学版);2011年05期

5 李建波;韩君;任杰;;Interaction of Human Fibroblasts with Electrospun Composites Gelatin/PLLA,Chitosan/PLLA and PLLA Fibrous Scaffolds[J];Journal of Shanghai Jiaotong University(Science);2012年05期

6 廖岚;YANG Shuang;Richard J Miron;WEI Junchao;ZHANG Yufeng;张萌;;In vitro Characterization of PBLG-g-HA/PLLA Nanocomposite Scaffolds[J];Journal of Wuhan University of Technology(Materials Science Edition);2014年04期

7 赵敏丽;隋刚;杨小平;邓旭亮;胡晓阳;;电纺丝PLLA/HA复合纤维支架的制备及体外降解性能研究[J];中国生物医学工程学报;2006年04期

8 靳巧锋;钟跃;欧静;陈元维;罗祥林;罗燕;彭玉兰;;过程参数对PLLA-PEG-PLLA微泡造影剂的性质影响[J];中国生物医学工程学报;2009年01期

9 马祖伟,高长有,龚逸鸿,沈家骢;型胶原在聚-L-乳酸(PLLA)表面的化学接枝和涂层及其对软骨细胞生长的促进作用[J];高等学校化学学报;2004年04期

10 石宗利,张媛,强小虎,王彦平,张国强,戴刚;CPP/PLLA单向纤维骨内固定复合材料制备和性能[J];机械工程学报;2004年11期

中国重要会议论文全文数据库 前10条

1 黄文娴;唐颂超;王婷兰;;稳态剪切对PLLA/PDLA结晶的影响[A];2013年全国高分子学术论文报告会论文摘要集——主题I：生物高分子与天然高分子[C];2013年

2 文伟;罗丙红;李彩荣;秦小鹏;周长忍;;基于静电纺丝构建改性HNTs/PLLA纳米纤维膜及其性能研究[A];2013广东材料发展论坛——战略性新兴产业发展与新材料科技创新研讨会论文摘要集[C];2013年

3 JING Nan;JIANG Xiaoting;WANG Qian;YANG Heli;张普敦;;FTIR Mapping for the Degradation of Polylactide/Inorganic Bioactive Materials[A];中国化学会第十七届全国有机分析与生物分析学术研讨会论文集[C];2013年

4 ;A supercritical CO_2 fluid technique for the preparation and evaluation of rhBMP-2-loaded PLLA microspheres[A];第九届全国生物力学学术会议论文汇编[C];2009年

5 石云云;杨静晖;张楠;黄婷;王勇;;基于TPU弹性体的PLLA增韧研究[A];2012年全国高分子材料科学与工程研讨会学术论文集（下册）[C];2012年

6 王君莲;王扬;郝红;;可注射PLLA-PEG-PLLA水凝胶的合成及表征[A];中国化学会第15届反应性高分子学术讨论会论文摘要预印集[C];2010年

7 郭若海;张凤波;谢续明;;分子末端基团诱导下的PLLA结晶行为研究[A];2010年全国高分子材料科学与工程研讨会学术论文集（上册）[C];2010年

8 王佐;滕新荣;任杰;;原位聚合制备Fe_3O_4/PLLA磁性复合微球及其表征[A];2006年上海市医用生物材料研讨会论文汇编[C];2006年

9 郭凯;申小清;张媛媛;陈金周;牛明军;刘玉坤;李新法;;PLLA/Talc/TBC复合材料的热分解动力学研究[A];颜色科学与技术——2012第二届中国印刷与包装学术会议论文摘要集[C];2012年

10 周雅婷;闫寿科;;取向有序PE基底对PCL-co-PLLA的结晶影响[A];2013年全国高分子学术论文报告会论文摘要集——主题C：高分子结构与性能[C];2013年

中国博士学位论文全文数据库 前10条

1 唐川;基于超临界流体技术的载药多孔材料制备及应用基础研究[D];浙江大学;2014年

2 高成成;聚乳酸自增强复合材料的制备、结构及性能研究[D];华南理工大学;2015年

3 刘瑞来;聚乳酸纳米纤维球晶多孔材料的制备及其结构性能研究[D];福建师范大学;2015年

4 韩婷;功能化聚硅氧烷微球的制备及其在聚乳酸中的应用[D];华东理工大学;2015年

5 王月明;同轴静电纺PLLA微阵列膜（MTAS）构建复合神经导管修复周围神经缺损的研究[D];上海交通大学;2015年

6 彭维海;新型可吸收材料PLLA/PLLA-gHA的生物降解性及生物力学性能的实验研究[D];吉林大学;2009年

7 马瑶;新型可吸收材料PLLA/PLLA-gHA对骨折愈合相关蛋白表达影响的实验研究[D];吉林大学;2010年

8 郝红;PLLA及其共聚物研究[D];西北工业大学;2005年

9 邵英;聚L-乳酸/聚L-乳酸接枝的纳米羟基磷灰石复合材料（PLLA/PLLA-gHA）的生物相容性研究[D];吉林大学;2007年

10 刘耕砚;多孔PLLA/n-HA/PES复合材料的制备、及其生物相容性的实验研究[D];中南大学;2013年

中国硕士学位论文全文数据库 前10条

1 邱大鹏;PLLA电纺膜动/静态环境下的降解及控释研究[D];天津大学;2010年

2 刘贝;改性氧化镁晶须/左旋聚乳酸生物复合材料制备与性能[D];天津理工大学;2015年

3 石莉;PLLA-TMC/PDLA-TMC立构复合材料的制备、结构与性能[D];复旦大学;2014年

4 王军丽;PLLA基复合材料的结晶行为及力学性能研究[D];郑州大学;2015年

5 刘颖颖;热致相分离法制备聚乳酸/聚己内酯复合球晶及其性能表征[D];福建师范大学;2015年

6 苏张林;静电纺丝聚乳酸/卵磷脂复合纳米纤维膜的制备及性能的研究[D];华南理工大学;2015年

7 郭有刚;PLLA/明胶纳米纤维膜在不同模拟体液中生物矿化过程研究[D];北京化工大学;2015年

8 张胜男;温度梯度场中PLLA与PVDF结晶行为及横晶结构研究[D];大连理工大学;2015年

9 赵宏伟;生物降解高分子聚左旋乳酸(PLLA)及聚(3-羟基丁酸酯-co-4-羟基丁酸酯)(P34HB)的改性研究[D];湘潭大学;2015年

10 朱杰;生物可降解聚乳酸结晶行为的控制研究[D];东华理工大学;2014年

  本文关键词：新型可注射、可降解、抗骨质疏松多功能骨水泥的体内外研究，由笔耕文化传播整理发布。

，

本文编号：444587