滑膜间充质干细胞和骨髓间充质干细胞在体内外成骨能力的比较研究

发布时间：2017-06-30 17:00

  本文关键词：滑膜间充质干细胞和骨髓间充质干细胞在体内外成骨能力的比较研究，由笔耕文化传播整理发布。

【摘要】：目的:探讨滑膜间充质干细胞(Synovial mesenchymal stem cells,SMSC)和骨髓间充质干细胞(Bone mesenchymal stem cells,BMSC)在体外成软骨、成骨潜能,评估SMSC与BMSC复合羟基磷灰石/壳聚糖/聚乳酸(hydroxylapatite/chitosan/poly L-latic acid,HA/CS/PLLA)骨修复材料在体内异位成骨能力,并比较SMSC与BMSC在体内外的成骨能力。方法:采用贴壁筛选法和酶消化法分别获得SMSC和BMSC,利用流式细胞仪对这二种细胞进行鉴定;取二种细胞分别进行成软骨、成骨诱导分化,利用甲苯胺蓝染色(Toluidine blue staining)鉴定成软骨分化,茜素红染色(Alizarin Red staining)和碱性磷酸酶染色(Alkaline phosphatase staining)鉴定成骨分化;利用MTT法检测P1、P2、P3代SMSC和BMSC细胞增殖率;取第3代SMSCs,成骨诱导1、7、14、21d后采用实时荧光定量PCR检测成软骨相关基因Ⅱ型胶原、蛋白聚糖,和成骨相关基因骨钙素(osteocalcin,OCN)、Ⅰ型胶原(Collagen typeⅠ,COLⅠ)、碱性磷酸酶(Alkaline phosphatase,ALP)以及Runx-2 m RNA表达情况,利用Elisa法检测成骨诱导后1、3、5、7、9和11d ALP活性,茜素红S法检测成骨诱导后7、14、21和28d各组钙盐沉积;取第3代SMSC,成骨诱导21d后利用Western-blot法检测各组OCN和RUNX-2蛋白表达情况;体内实验中取第3代SMSC和BMSC接种于HA/CS/PLLA支架材料植入大鼠右下肢肌袋内作为实验组,以植入单纯HA/CS/PLLA支架材料为对照组,术后8周通过X线片及组织学观察并分析SMSC和BMSC体内成骨情况。结果:提纯后SMSC和BMSC表面抗原CD90、CD105、CD147、CD44表达均超过95%,而CD34、CD117、CD14、CD45表达均低于10%;油红O染色可见红色脂滴形成,茜素红染色可见红色钙化灶,ALP染色可见细胞质咖啡样深染;P1代SMSC与BMSC细胞生长缓慢,呈直线性生长,P2、P3代SMSC与BMSC细胞则呈“S”形生长;SMSC和BMSC成骨诱导14d后Ⅱ型胶原、蛋白聚糖基因表达明显增高,且SMSC组表达明显高于BMSC组(P0.05),SMSC和BMSC成骨诱导7d后Ⅰ型胶原、ALP、OCN、Runx-2表达阳性,且BMSC表达显著高于SMSC组(P0.05);成骨诱导3 d后ALP活性开始呈阳性,且BMSC组明显高于SMSC组,7 d时达峰值(P0.05);而成骨诱导14 d钙含量表达阳性,BMSC组明显高于SMSC组,随着诱导时间延长钙含量逐渐增加(P0.05)。术后8周X线片显示SMSC与BMSC组均有高密度影,灰度值分析显示BMSC组灰度值显著高于SMSC组;组织学结果显示,两组均可见新生骨形成,但BMSC组成骨量明显多于SMSC组(P0.05)。结论:SMSC和BMSC在体内外均具有成软骨和成骨特性,且BMSC在体内外的成骨能力均高于SMSC。
【关键词】：滑膜间充质干细胞 骨髓间充质干细胞 碱性磷酸酶 骨钙素 大鼠
【学位授予单位】：皖南医学院
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2016
【分类号】：R68
【目录】：

• 中英文缩略词对照表5-7
• 摘要7-9
• Abstract9-11
• 前言11-14
• 研究材料（资料与内容）与方法14-30
• 1 研究内容14
• 2 实验材料14-16
• 3 实验方法16-29
• 3.1 原代的提取16-17
• 3.2 细胞的培养和传代17
• 3.3 流式细胞仪检测细胞表面抗原17
• 3.4 细胞的诱导分化17-18
• 3.5 MTT 法检测各代细胞增殖率18-19
• 3.6 实时荧光定量PCR检测相关基因的表达19-23
• 3.7 ELISA法检测ALP活性23
• 3.8 茜素红S法检测钙盐沉积23-24
• 3.9 Western-blot法检测OCN和RUNX-2蛋白表达24-29
• 3.10 体内实验观察29
• 4 统计学方法29-30
• 结果30-37
• 讨论37-46
• 结论46-47
• 参考文献47-52
• 综述52-61
• 参考文献58-61
• 作者简介及读研期间主要科研成果61-62
• 致谢62

【参考文献】

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本文编号：502671