烟酸缓释剂在大鼠糖尿病视网膜病变的治疗作用及机制探讨

发布时间：2017-11-03 06:25

  本文关键词：烟酸缓释剂在大鼠糖尿病视网膜病变的治疗作用及机制探讨

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【摘要】：目的:本实验研究通过STZ诱导建立Wistar大鼠糖尿病视网膜病变(Diabetic Retinopathy,DR)模型并应用烟酸缓释剂干预治疗,研究其对大鼠DR模型的治疗作用,并探讨其作用发生的机制。方法:(1)6-8周雄性成年Wistar大鼠150只,分为正常(CON)组(50只鼠)、糖尿病(DM)组(50只鼠)、烟酸(NA)干预组(50只鼠)。由大鼠的尾静脉使用注射器注射STZ诱导糖尿病模型,治疗组于造模第7天开始以烟酸(40mg/kg/day)连续灌胃治疗,对照组正常喂食水。造模后第3个月摘除大鼠眼球行HE染色,进行病理评估;各组大鼠检测体重、血糖、胆固醇以及HDL含量;EB血管灌注造影视网膜铺片及伊文思蓝渗漏量定量检测BRB的破坏程度;TUNEL法检测大鼠视网膜RGC细胞凋亡情况;免疫组化检测Claudin-5、Occludin、VEGF/VEGFR、Tie-2、VCAM-1、TNF-α、CD45的表达情况;Western blot检测VEGF/VEGFR、Ang-1/Tie-2、VCAM-1/ICAM-1、NF-κB/TNF-α、IL-6、i NOS、ZO-1的蛋白表达量;q RT-PCR检测micro RNA-126(mi R-126)、Claudin-5、Occludin、ZO-1、ICAM-1、NF-κB、i NOS的m RNA相对表达量。(2)人视网膜微血管内皮细胞培养,分为正常细胞(CON)组、高糖培养基(HI)组、高糖培养基+烟酸干预(NA)组、高糖培养基+烟酸干预+micro RNA-126抑制剂(NI)组。对照组普通ECM培养基培养,其他3组高糖培养基培养。4组分别于培养8天后处理进行PCR和Western blot检测,PCR检测每组的micro RNA-126的表达量,Western blot检测VEGF和Ang-1的蛋白表达量。结果:(1)干预三个月后DM组大鼠血糖平均量较CON组明显升高,体重明显下降,差异有统计学意义(t=9.45、25.01,P0.05);NA组血糖较DM组无明显变化,差异无统计学意义(P0.05),体重平均量较DM组明显升高,差异具有统计学意义(t=6.93,P0.05)。DM组胆固醇平均量较CON组明显增高,差异有统计学意义(t=4.034,P0.05);NA组胆固醇平均量较DM组明显减少,差异有统计学意义(t=6.868,P0.05);DM组HDL平均量较CON组明显降低,差异有统计学意义(t=5.831,P0.05);NA组HDL平均量较DM组明显升高,差异有统计学意义(t=3.369,P0.05)。CON组大鼠视网膜各层结构排列清晰,细胞结构完整、形态未见明显异常;DM组大鼠视网膜各层结构紊乱,细胞结构异常,细胞核肿胀,可见出血和炎性细胞浸润,一些血管明显扩张;NA组大鼠视网膜结构排列整齐,未见出血和炎性细胞,细胞渐规则。DM组EB血管灌注视网膜铺片与正常对照组大鼠相比,充盈EB的血管荧光外渗,DM组EB平均渗漏量较CON组明显增高,差异有统计学意义(t=24.712,P0.05);NA组较DM组EB外渗减少,NA组EB平均渗漏量较DM组明显减少,差异有统计学意义(t=16.414,P0.05)。TUNEL检测显示DM组大鼠凋亡的视网膜细胞相对于CON组明显增加,差异具有统计学意义(t=18.28,P0.05);NA组大鼠视网膜RGC凋亡细胞较DM组明显减少,差异具有统计学意义(t=6.17,P0.05)。免疫组化结果显示DM组VEGF/VEGFR、VCAM-1、TNF-α、CD45相对表达量较CON组明显升高,差异有统计学意义(t=12.02、12.88、11.24、15.60、7.64,P0.05);NA组大鼠视网膜VEGF/VEGFR、VCAM-1、TNF-α、CD45相对表达量较DM组明显降低,差异有统计学意义(t=6.44、11.58、7.49、8.83、3.82,P0.05)。DM组大鼠视网膜闭合蛋白(Occludin)和封闭蛋白(Claudin)-5相对表达量较CON组明显降低,差异有统计学意义(t=4.36、13.05,P0.05);NA组大鼠视网膜Occludin和Claudin-5相对表达量较DM组明显增高,差异有统计学意义(t=3.62、7.30,P0.05)。NA组大鼠视网膜Tie-2相对表达量较DM组明显增高,差异有统计学意义(t=3.79,P0.05)。Western Blot结果示DM组大鼠视网膜VEGF/VEGFR、VCAM-1/ICAM-1、TNF-α/NF-κB、IL-6、i NOS的相对表达量较CON组明显升高,差异有统计学意义(t=5.45、3.51、7.44、19.48、6.58、8.95、11.11、6.12,P0.05);NA组大鼠视网膜VEGF/VEGFR、VCAM-1/ICAM-1、TNF-α/NF-κB、IL-6、i NOS相对表达量较DM组明显降低,差异有统计学意义(t=2.63、2.05、4.25、16.92、5.02、4.40、10.13、5.45,P0.05)。ZO-1蛋白的相对表达量较CON对照组大鼠明显降低,差异具有统计学意义(t=14.10,P0.05),NA组大鼠视网膜较DM组大鼠明显升高,差异有统计学意义(t=5.77,P0.05)。Ang-1/Tie-2蛋白的相对表达量NA组大鼠视网膜较DM组大鼠明显升高,差异有统计学意义(t=4.50、4.42,P0.05)。PCR结果显示DM组大鼠视网膜紧密连接蛋白Occludin、Claudin-5、ZO-1相对表达量较CON组明显降低,差异有统计学意义(t=11.422、12.638、12.060,P0.05);NA组大鼠视网膜Occludin、Claudin-5、ZO-1 m RNA相对表达量较DM组明显增高,差异有统计学意义(t=5.278、3.952、8.030,P0.05)。DM组大鼠视网膜ICAM-1、NF-κB、i NOS m RNA相对表达量较CON组明显升高,差异有统计学意义(t=11.422、12.638、12.060,P0.05);NA组大鼠视网膜ICAM-1、NF-κB、i NOS m RNA相对表达量较DM组明显降低,差异有统计学意义(t=5.278、3.952、8.030,P0.05)。DM模型组micro RNA-126的表达量较CON对照组降低,差异具有统计学意义(t=15.53,P0.05);NA组mi R-126相对表达量较DM模型组明显升高,差异具有统计学意义(t=7.18,P0.05)。(2)细胞光镜结果显示,CON组细胞生长状态良好,呈梭形,贴壁牢固,细胞连接十分紧密,边界完整清楚,呈单层“铺路石”样排列;HI和NI组细胞部分皱缩、变圆,细胞间隙增大,可见大量细胞脱落;NA组较HI组细胞生长状态较好,呈梭形。PCR结果显示,mi R-126表达量HI组较CON组明显降低,差异具有统计学意义(t=13.43,P0.05);NA组较HI组明显升高,差异具有统计学意义(t=4.62,P0.05);NI组较NA组明显降低,差异具有统计学意义(t=7.16,P0.05)。Western blot的结果显示,HI组与CON对照组相比,VEGF表达量明显升高,差异具有统计学意义(t=8.54,P0.05);NA干预组与HI高糖组相比,VEGF表达量明显降低,差异具有统计学意义(t=7.76,P0.05);NI组与NA干预组相比,VEGF表达量明显升高,差异具有统计学意义(t=6.95,P0.05);NA干预组与HI高糖组相比,Ang-1表达量明显升高,差异具有统计学意义(t=16.25,P0.05);NI组与NA干预组相比,Ang-1表达量明显降低,差异具有统计学意义(t=4.24,P0.05)。结论:(1)大鼠尾静脉注射STZ可成功诱导DR实验模型;(2)烟酸缓释剂能够改善Wistar大鼠DR模型的组织病理学表现(3)烟酸缓释剂具有修复血管作用,维持DR大鼠BRB完整性,烟酸的修复血管作用可能是通过micro RNA-126信号通路实现的。(4)烟酸具有抑制血管炎症的作用,能够调节炎症因子的表达,其作用可能是通过NF-κB通路实现的。
【关键词】：糖尿病视网膜病变 烟酸 血-视网膜屏障 microRNA-126 VEGF Ang-1 TNF-α NF-κB
【学位授予单位】：天津医科大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2016
【分类号】：R587.2;R774.1
【目录】：

• 中文摘要4-7
• Abstract7-14
• 缩略语/符号说明14-16
• 前言16-19
• 研究现状、成果17
• 研究目的、方法17-19
• 一、烟酸对于大鼠糖尿病视网膜病变的影响19-56
• 1.1 实验动物、主要仪器与试剂19-24
• 1.1.1 实验对象19
• 1.1.2 主要仪器19-20
• 1.1.3 主要试剂20-22
• 1.1.4 主要试剂配制22-24
• 1.2 实验方法24-36
• 1.2.1 大鼠DM动物模型的建立24
• 1.2.2 成模后检测、分组及药物干预24
• 1.2.3 大鼠血液总胆固醇及HDL的检测24
• 1.2.4 视网膜切片的HE染色24-25
• 1.2.5 视网膜免疫组织化学染色检测Claudin-5、Occludin、VEGF、VEGFR、Tie-2、CD45、VCAM-1、TNF-α25-26
• 1.2.6 伊文思蓝(EB)血管灌注造影视网膜铺片26-27
• 1.2.7 视网膜组织伊文思蓝(EB)渗漏量检测27
• 1.2.8 视网膜TUNEL染色27-28
• 1.2.9 Western blot检测VEGF、VEGFR、Ang-1、Tie-2、VCAM-1、ZO-1、IL-6、TNF-α、NF-κB、 ICAM-1、iNOS在视网膜组织的表达28-31
• 1.2.10 qRT-PCR 检测紧密连接蛋白 Occludin、Claudin-5、ZO-1、NF-κB、ICAM-1、iNOS 在视网膜组织的表达31-34
• 1.2.11 qRT-PCR检测miR-126在视网膜组织的表达34-36
• 1.3 统计学方法36
• 1.4 结果36-52
• 1.4.1 糖尿病动物模型的建立36
• 1.4.2 大鼠血糖及体重的情况36-37
• 1.4.3 各组大鼠总胆固醇以及HDL水平37-38
• 1.4.4 视网膜HE染色38-39
• 1.4.5 视网膜免疫组化检测结果39-42
• 1.4.6 血管灌注造影视网膜铺片结果42-43
• 1.4.7 视网膜伊文思蓝(EB)渗漏量测定43-44
• 1.4.8 TUNEL染色视网膜细胞凋亡44-45
• 1.4.9 视网膜Western blot检测结果45-50
• 1.4.10 视网膜qRT-PCR检测结果50-52
• 1.5 讨论52-55
• 1.6 小结55-56
• 二．烟酸对高糖HREC的作用56-69
• 2.1 实验对象、主要仪器与试剂56-59
• 2.1.1 实验对象56
• 2.1.2 实验仪器56-57
• 2.1.3 实验试剂57-58
• 2.1.4 主要试剂、液体的配制58-59
• 2.2 实验方法59-64
• 2.2.1 HREC培养59
• 2.2.2 实验分组59-60
• 2.2.3 qRT-PCR检测miR-126在细胞的表达60-62
• 2.2.4 细胞Western blot检测62-64
• 2.3 统计学方法64
• 2.4 结果64-67
• 2.4.1 HREC形态变化及生长状况64-65
• 2.4.2 各组miR-126 的检测65-66
• 2.4.3 细胞Western blot检测结果66-67
• 2.5 讨论67-68
• 2.6 小结68-69
• 全文结论69-70
• 论文创新点70-71
• 参考文献71-74
• 发表论文和参加科研情况说明74-75
• 综述 MicroRNA在糖尿病视网膜病变中的研究进展75-81
• 综述参考文献78-81
• 致谢81-82
• 个人简历82

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