TLR2调控角膜移植术后MDSC分化及DC成熟

发布时间：2018-01-18 04:03

本文关键词：TLR2调控角膜移植术后MDSC分化及DC成熟　出处：《南方医科大学》2017年硕士论文　论文类型：学位论文

【摘要】：研究背景角膜移植手术是目前治疗不可逆性角膜盲唯一有效手段。尽管角膜一直被称作“免疫赦免”组织,但移植术后的免疫排斥反应仍是导致移植失败最主要的原因。角膜移植排斥反应是以CD4+T细胞介导为主的Th1型免疫反应。干扰素-γ(Interferon-γ,IFN-γ)的增高决定T细胞向Th1方向分化,是Th1型免疫反应的特征性因子。CD4+T细胞的激活不仅需要T细胞表面受体(T cell receptor,TCR)-主要组织相容性抗原(Major histocompatibility complex,MHC)肽复合体的结合,还需要抗原提呈细胞(Antigen-presenting cell,APC)提呈抗原。骨髓抑制性细胞(Myeloid-derived suppressor cell,MDSC)是 APC 的前体,不具备抗原提呈功能,无法激活T细胞。另外,MDSC也可通过多种途径抑制T细胞活化。其中最主要的途径是分泌诱导型一氧化氮合酶(Inducednitricoxide synthase,INOS),降低T细胞活性。树突状细胞(Dendriticcell,DC)是目前认为最有效的APC。成熟后的DC(Mature DC,mDC),表面高表达B7/BB1(CD80/CD86)分子,这是递呈抗原从而激活T细胞的必备条件。因此,MDSC、DC的产生和活化与CD4+T细胞激活关系十分密切。Toll样受体(Toll like receptor,TLR)2是广泛表达于免疫细胞表面的模式识别受体。我们课题组前期研究已经发现,TLR2可能参与了大鼠角膜移植术后免疫排斥反应的发生,但其具体机制仍不十分明确。在体外实验中,已经发现激活TLR2可以促进MDSC向DC分化,并对MDSC活化和DC成熟有一定影响。因此我们猜测TLR2可能通过调控MDSC分化和DC成熟参与角膜移植术后免疫排斥反应的发生。本实验将利用TLR2基因敲除小鼠建立同种异体角膜移植模型,与野生型同种异体角膜移植小鼠进行比较,从而验证TLR2与角膜移植术后免疫排斥反应发生的关系,并进一步探究这一现象背后的机制。实验一 TLR2敲除后可延长角膜植片生存时间研究目的验证TLR2参与角膜移植术后免疫排斥反应的发生。研究方法以野生型C57BL/6和TLR2基因敲除小鼠为受体,BABL/c小鼠为供体,在受体小鼠右眼行同种异体角膜移植术,分别设为野生组(WT组)和基因敲除组(TLR2KO组);另外于C57BL/6小鼠右眼行自体角膜移植术,设为自体组(ISO组)。未经手术处理的C57BL/6和TLR2基因敲除小鼠分别设为野生对照组(WT control)和基因敲除对照组(KO control)。术后2次/周裂隙灯下观察植片水肿程度和透明度,参照Sonoda评分标准对排斥指数(Reject index,RI)进行评分并计算中位生存时间(Median survival time,MST)。比较WT组与TLR2 KO组间植片生存时间长短。研究结果术后随时间变化各手术组植片水肿和混浊程度不一,以WT组最为严重。比较角膜 RI 评分显示,术后 7d、14d、21d、28d、35d、42d、49d和56d,TLR2 KO组RI评分均低于WT组(P0.05)。比较MST结果显示,TLR2 KO组(35.0±3.8)d明显长于WT组(21.0±1.5)d(P0.05)。生存分析结果显示,TLR2 KO组角膜生存时间明显长于WT组(P0.001),术后14d TLR2 KO组角膜生存率为100%,而WT组仅为70%。结论TLR2敲除后可延长角膜植片生存时间,再次验证TLR2可能参与角膜移植术后免疫排斥反应的发生。实验二TLR2调控角膜植片局部免疫反应发生研究目的探究TLR2是否调控同种异体移植角膜植片局部的免疫反应的发生。研究方法建立WT组、TLR2 KO组、ISO组、WT control组和KO control组五组小鼠(方法同前)。术后14d,收集术眼角膜行HE染色分析炎症细胞浸润程度;免疫组织化学染色检测角膜TLR2及Thl细胞因子(IFN-γ)蛋白表达;实时荧光定量PCR检测TLR2及IFN-y mRNA的表达;同时收集术眼同侧颈部淋巴结行流式细胞术分析CD4+T细胞(CD3+CD4+)的比例。研究结果TLR2免疫组织化学和PCR结果显示,TLR2 KO组角膜几乎不表达TLR2分子,ISO组有微量表达,WT组表达明显增高。HE染色结果显示,WT组角膜基质层出现水肿和大量炎性细胞,而TLR2KO组炎症反应较轻。流式细胞分析结果显示,WT组同侧颈部淋巴结中CD4+T细胞数量明显高于TLR2KO组(P0.05)。免疫组织化学和PCR结果显示,WT组相对于TLR2KO组,角膜植片内IFN-y表达增高(P0.05)。结论TLR2表达高低与植片局部免疫反应强弱相关,提示TLR2可能参与了同种异体移植角膜植片局部的免疫反应的发生。实验三TLR2调控MDSC分化及DC成熟研究目的探究TLR2是否调控MDSC分化及DC成熟。研究方法建立WT组、TLR2 KO组、ISO组、WT control组和KO control组五组小鼠(方法同前)。术后14d,收集术眼角膜行实时荧光定量PCR检测INOSmRNA表达分析各组MDSC功能差异;免疫荧光染色检测角膜局部MDSC、DC数量分析各组MDSC向DC分化的情况,以及CD80/CD86表达强弱分析各组DC成熟的情况。同时收集术眼同侧颈部淋巴结行流式细胞术定量分析MDSC(CD11b+GR-1+)、DC(CD11c+)的比例和和 mDC(CD11c+CD86high/CD80high)的表达。研究结果PCR结果显示,WT组与TLR2 KO组间角膜局部INOS mRNA表达无明显的差异(P0.05)。MDSC和DC的流式细胞分析和免疫荧光结果结果显示,WT组相对于TLR2KO组,眼球局部MDSC数量减少(P0.05),但DC的数量增多(P0.05)。流式细胞分析结果和免疫荧光结果均显示,WT组相对于TLR2 KO组,DC表面CD86/CD80分子表达高(P0.05),DC成熟度高。结论TLR2可能参与了角膜移植术后MDSC向DC分化及DC成熟,但TLR2缺乏并不影响MDSC活化。
[Abstract]:In vitro experiments , it has been found that TLR2 can promote the differentiation of immune rejection after corneal transplantation . In addition , C57BL / 6 and TLR2 knockout mice were divided into wild control group ( WT control ) and knockout control group ( KO control ) . The degree of edema and the transparency of the implant were observed at 2 / week after operation , and the rejection index ( RI ) was scored and the median survival time ( MST ) was calculated with reference to the Sonoda scoring standard . The results showed that TLR2 KO group ( 33.0 卤 3.8 ) d was significantly longer than that in WT group ( P0.05 ) . The expression of MDSC ( CD11c + ) , DC ( CD11c + ) and DC ( CD11c + CD86high / CD80high ) were analyzed by flow cytometry . The results showed that TLR2 could be involved in the differentiation of MDSCs to DC and DC maturation relative to TLR2 KO group . Conclusion TLR2 may be involved in DC differentiation and DC maturation in WT group compared with TLR2 KO group , but TLR2 lacks and does not affect MDSC activation .

【学位授予单位】：南方医科大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2017
【分类号】：R779.65

【参考文献】