CTR1、ATP7A、ATP7B在大鼠顺铂耳毒性中的作用与硫酸铜的干预研究

发布时间：2018-01-27 04:53

本文关键词： 顺铂圆窗耳蜗 CTR1 ATP7A ATP7B 耳蜗硫酸铜圆窗顺铂耳毒性　出处：《中南大学》2012年博士论文　论文类型：学位论文

【摘要】：目的：研究顺铂的不同给药方法对大鼠耳蜗的功能和形态影响,探讨建立顺铂耳聋动物模型的有效方法。方法： Wistar雄性大鼠随机分为三组,组Ⅰ为生理盐水圆窗用药组(6只),组Ⅱ为顺铂圆窗用药组(6只),组Ⅲ为顺铂腹腔注射组(6只)。采用听性脑干反应、耳蜗中轴石蜡切片HE染色及基底膜苏木素染色毛细胞计数技术来评估大鼠的功能和形态改变情况。结果： 1.听性脑干反应检测：组Ⅰ动物在用药前后听阈提高了1.66±4.08dB SPL,差异无统计学意义(p0.05),组Ⅱ与组Ⅲ动物用药前后听阈分别提高56.67±17.51dB SPL、41.67±14.72dB SPL,差异有显著的统计学意义(P0.01)。组Ⅱ、组Ⅲ分别与组~比较,差异均有显著的统计学意义(P0.01)。组Ⅱ与组Ⅲ比较,差异无统计学意义(p0.05)。 2.耳蜗中轴切片HE染色：组Ⅰ动物Corti's器、螺旋神经节、血管纹形态正常。组Ⅱ与组Ⅲ动物Corti's器皱缩,外毛细胞断裂甚至缺失；螺旋神经节细胞数目减少,细胞核变小；神经纤维排列紊乱；血管纹结构紊乱,细胞水肿样变。 3.耳蜗基底膜铺片及毛细胞计数：组Ⅰ毛细胞排列紧密、染色均匀、未见到内、外毛细胞有明显缺失。组Ⅱ外毛细胞缺失明显,尤以第一排、第二排明显,内毛细胞排列整齐,仅见少量缺失。组Ⅲ以外毛细胞缺失为主,内毛细胞基本保持完好。毛细胞计数显示组Ⅰ内、外毛细胞平均缺失率低,各回的外毛细胞平均缺失率与组Ⅱ、组Ⅲ比较,差异均有统计学意义(P0.05)。组Ⅱ与组Ⅲ的毛细胞缺失以底回的外毛细胞为主,中回次之,顶回无明显的外毛细胞缺失,比较组Ⅱ与组Ⅲ各回外毛细胞的平均缺失率,差异不明显,无统计学意义(P0.05)。各组的内毛细胞缺失率均较低。结论： 1.开放听泡从圆窗用药的手术操作不会引起内耳的形态学改变和功能的变化。 2.采用顺铂(1mg/ml)圆窗给药的方法能够成功建立顺铂耳毒性的大鼠模型,有操作方法简单,致死率低,动物状态好等优点。目的：了解铜离子转运蛋白家族中CTR1、ATP7A、ATP7B蛋白在大鼠顺铂耳毒性中的空间分布特点和表达量的改变；硫酸铜、顺铂圆窗给药后对CTR1、ATP7A、ATP7B蛋白表达的影响,为探讨顺铂耳毒性的防治提供理论基础。方法： Wistar雄性大鼠随机分为4组,组Ⅰ正常对照组(非处理组,6只),组Ⅱ硫酸铜(0.02mg/kg)圆窗浸润组(6只),组Ⅲ硫酸铜(0.04mg/kg)圆窗浸润组(6只),组Ⅳ顺铂(1mg/ml)圆窗浸润组(6只)。采用免疫组织化学技术,对各组近中轴位耳蜗石蜡切片行CTR1、ATP7A、ATP7B蛋白的免疫组织化学染色,光学显微镜下观察耳蜗组织中的表达情况。提取各组耳蜗组织总蛋白,应用Western-blot技术检测各组CTR1、ATP7A、ATP7B蛋白表达水平。提取耳蜗组织的总RNA,应用RT-PCR技术检测各组CTR1mRNA、 ATP7A mRNA、ATP7B mRNA的表达水平。结果： 1.免疫组化检测CTR1、ATP7A、ATP7B蛋白的表达：正常对照组和实验各组的耳蜗各回Corti's器、螺旋神经节、血管纹的细胞质和细胞膜上均检测到了CTR1、ATP7A、ATP7B的表达。IPP6.0软件分析其平均光密度值显示CTR1的平均光密度值呈现降低趋势,而ATP7A和ATP7B的平均光密度值呈现增高趋势。 2.Western-blot技术检测CTR1、ATP7A、ATP7B蛋白的表达：CTR1、ATP7A、ATP7B蛋白在各组的耳蜗组织均有明显的表达,采用bandscan6.0对各个条带进行光密度分析,结果用目的条带与beta-actin条带的光密度比值来表示。CTR1蛋白的光密度分析显示各组分别为0.532±0.031、0.3944-0.024、0.234±0.030和0.191±0.015呈下降的趋势,组与组之间比较,差异有统计学意义(P0.05)；ATP7A蛋白的光密度值分别为0.149±0.012、0.2744±0.026、0.420±0.030和0.515±0.021,呈上升的趋势,组与组之间比较,差异有统计学意义(P0.05)。ATP7B蛋白的光密度值分别为0.146±0.013、0.273±0.027、0.423±0.027和0.513±0.053,呈上升的趋势,组与组之间比较,有统计学意义(P0.05)。 3.RT-PCR检测CTR1mRNA、ATP7A mRNA、ATP7B mRNA的表达：CTR1mRNA、ATP7A mRNA、ATP7B mRNA在各组的耳蜗组织均有明显的表达,采用bandscan6.0对各个条带进行光密度分析,结果用目的条带与beta-actin条带的光密度比值来表示。CTR1mRNA的光密度分析显示各组分别为0.508±0.035、0.391±0.022、0.240±0.023和0.186±0.021,呈下降的趋势,组与组之间比较,差异均有统计学意义(P0.05)；ATP7A mRNA光密度分析显示分别为0.148±0.012、0.262±0.025、0.423±0.029和0.510±0.056,呈上升的趋势,组与组之间比较,差异均有统计学意义(P0.05)。ATP7B mRNA的光密度分析显示0.144±0.013、0.267±0.023、0.416±0.019和0.509±0.059呈上升的趋势,组与组之间比较,差异均有统计学意义(P0.05)。结论： 1.CTR1、ATP7A、ATP7B蛋白在各组的耳蜗Corti's器、螺旋神经节、血管纹均有明显的表达,提示CTR1、ATP7A、ATP7B蛋白参与了顺铂和铜离子在内耳的转运。 2.铜离子圆窗给药能够促进CTR1蛋白表达的下降和ATP7A和ATP7B蛋白的表达的升高,提示CTR1、ATP7A、ATP7B蛋白在内耳细胞中发挥维持铜离子平衡的作用。 3.圆窗给药建立的大鼠耳毒性模型中CTR1蛋白表达下降和ATP7A、ATP7B蛋白表达升高,提示内耳细胞可能通过调节CTR1、ATP7A、ATP7B蛋白的表达量来减少顺铂的吸收,这可能是内耳细胞拮抗顺铂耳毒性的一种自身反馈机制。目的：探讨硫酸铜圆窗给药对顺铂耳毒性的保护作用,为硫酸铜局部给药治疗顺铂耳毒性提供理论依据。方法： Wistar雄性大鼠随机分为三组,组Ⅰ生理盐水圆窗浸润30min+顺铂腹腔给药20mg/kg(6只),组Ⅱ硫酸铜圆窗浸润30min+顺铂腹腔给药20mg/kg(6只),组Ⅲ硫酸铜圆窗浸润4h+顺铂腹腔给药20mg/kg(6只)。采用听性脑干反应、耳蜗中轴石蜡切片HE染色及基底膜苏木素染色毛细胞计数技术评估硫酸铜对顺铂耳毒性的保护作用。结果： 1.听性脑干反应检测：组Ⅰ、组Ⅱ和组Ⅲ大鼠在顺铂腹腔给药和耳部干预之后听力阈值分别升高53.33±15.06、15.00±5.48和18.33+7.53。组Ⅰ与组Ⅱ、组Ⅰ与组Ⅲ之间听阈的改变有显著的统计学差异(P0.01),组Ⅱ与组Ⅲ之间听阈的改变无明显的统计学差异(P0.05)。 2.耳蜗中轴切片HE染色：组Ⅰ耳蜗毛细胞缺失明显,结构欠清晰,盖膜消失；螺旋神经节细胞水肿,细胞核变小,数目减少；神经纤维排列紊乱；血管纹结构紊乱。组Ⅱ耳蜗毛细胞结构清晰,盖膜完整；螺旋神经节细胞排列紧密,细胞核大,细胞质少；神经纤维呈条索状,分布均匀,排列整齐；血管纹形态正常,结构清晰。组Ⅲ耳蜗毛细胞未见明显的损害；螺旋神经节细胞排列整齐,细胞核染色均匀；神经纤维呈条索状,分布均匀,排列整齐；血管纹形态正常,结构清晰。 3.耳蜗基底膜铺片及毛细胞计数显示：组Ⅰ外毛细胞缺失明显、排列紊乱。内毛细胞完整,损害不明显。组Ⅱ外毛细胞染色均匀、仅见少数细胞缺失；内毛细胞排列整齐、染色均匀。组Ⅲ外毛细胞染色均匀、排列整齐、少数外毛细胞缺失；内毛细胞排列整齐、染色均匀。毛细胞计数结果显示,组Ⅰ外毛细胞损害较重,以底回为主,中回次之,顶回缺失较少,比较组Ⅰ与组Ⅱ,组Ⅰ与组Ⅲ的各回外毛细胞平均缺失率,差异均有统计学意义(P0.05)。比较组Ⅱ与组Ⅲ的各回的平均毛细胞缺失率,差异无明显的统计学意义。各组内毛细胞的缺失率均较低。结论：硫酸铜圆窗给药能减轻顺铂对内耳的形态和功能的影响,其机制可能是通过减少内耳细胞对顺铂的摄取来发挥耳保护作用。
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【学位授予单位】：中南大学
【学位级别】：博士
【学位授予年份】：2012
【分类号】：R764

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