FoxMl及其抑制剂在喉癌生长转移中的作用及机制

发布时间：2018-02-03 09:01

  本文关键词： FoxM1 喉癌 硫链丝菌肽 RNA干扰 抑制剂　出处：《重庆医科大学》2015年博士论文　论文类型：学位论文

【摘要】：目的：1、研究在体外环境下抑制剂硫链丝菌肽下调FoxM1表达后对喉癌Hep-2细胞增殖、凋亡、侵袭、转移、克隆形成能力的影响及其中的分子机制。2、研究在体内环境下抑制剂硫链丝菌肽下调FoxM1表达后对喉癌Hep-2细胞体内生长的影响及分子机制。3、研究通过RNA干扰下调FoxM1表达后对喉癌Hep-2细胞体外克隆形成能力,以及在体内生长的影响。方法：1、运用反转录-聚合酶链反应(RT-PCR)法和免疫印迹(western blot)法检测硫链丝茵肽对Hep-2细胞中FoxMl表达的影响。2、运用CCK-8法检测硫链丝菌肽下调FoxMl后对Hep-2细胞细胞活力的影响。3、运用CFSE作为探针染色Hep-2细胞,通过流式细胞仪检测硫链丝菌肽下调FoxM1对Hep-2细胞增殖的影响。通过流式细胞仪检测硫链丝菌肽下调FoxM1对Hep-2细胞细胞周期的影响。运用RT-PCR法和western blot法检测硫链丝菌肽下调FoxM1后对细胞周期蛋白cyclinD1和cyclinE1的表达水平的影响。4、运用Annexin V-FITC/PI双染法和流式细胞仪检测硫链丝菌肽下调FoxM1对Hep-2细胞凋亡的影响。运用Tunel法进一步验证硫链丝菌肽下调FoxM1对Hep-2细胞凋亡的影响。运用RT-PCR法和western blot法检测硫链丝菌肽下调FoxM1后对Bcl-2、Bax、p53的mRNA和蛋白表达水平的影响。运用JC-1作为探针染料,流式细胞仪检测硫链丝菌肽下调FoxM1对Hep-2细胞线粒体膜电位的影响。运用western blot法检测链丝菌肽下调FoxM1对Hep-2细胞中细胞色素C、cleaved caspase-9、cleaved caspase-3和cleaved PARP的蛋白表达水平的影响。通过Annexin V-FITC/PI双染法和流式细胞仪检测经caspase抑制剂z-VAD-fmk预处理后的硫链丝菌肽对Hep-2细胞凋亡的影响,以及通过western blot法检测其中cleaved caspase-3的表达变化。运用 western blot法检测链丝菌肽下调FoxM1对Hep-2细胞中的FADD、cleaved caspase-8、cIAP1、XIAP和survivin蛋白表达水平的影响。5、运用侵袭实验和迁移实验检测硫链丝菌肽下调FoxM1对Hep-2细胞侵袭、迁移能力的影响。运用RT-PCR法和ELISA法检测硫链丝菌肽下调FoxM1对Hep-2细胞中MMP-2、MMP-9的mRNA表达水平,以及Hep-2细胞上清液中MMP-2、MMP-9蛋白表达水平的影响。6、运用软琼脂克隆形成实验检测硫链丝菌肽下调FoxM1对Hep-2细胞克隆形成能力的影响。7、构建裸鼠移植瘤模型观察硫链丝菌肽下调FoxM1对Hep-2细胞在体内生长的影响。通过western blot法和免疫组织化学法检测硫链丝菌肽作用后对裸鼠肿瘤组织中FoxM1、Ki67和cleaved caspase-3蛋白表达水平的影响。8、通过慢病毒侵染Hep-2细胞,构建稳定转染FoxM1shRNA Hep-2细胞株。运用软琼脂克隆形成实验检测RNA干扰下调FoxM1对Hep-2细胞克隆形成能力的影响。运用裸鼠移植瘤模型观察RNA干扰下调FoxM1对Hep-2细胞在裸鼠体内肿瘤生长的影响。结果：1、经硫链丝菌肽作用后Hep-2细胞中FoxM1的mRNA和蛋白表达水平明显降低。2、硫链丝菌肽通过下调FoxM1表达抑制了Hep-2细胞细胞活力。3、硫链丝菌肽通过下调FoxM1表达抑制了Hep-2细胞分裂增殖,将细胞周期阻滞于S期,同时导致了细胞周期蛋白cyclinD1和cyclinE1的表达下调。4、硫链丝菌肽通过下调FoxM1促进了Hep-2细胞凋亡。硫链丝菌肽还下调Bcl-2表达,上调Bax、p53表达,促使线粒体膜电位下降,引起细胞色素C从线粒体中释放到细胞胞浆中,激活cleaved caspase 9、 cleaved caspase-3和cleaved PARP,说明线粒体-caspase通路参与其中。其次,硫链丝菌肽下调FoxMl还导致Hep-2细胞中FADD和cleaved caspase-8的蛋白表达水平增加,说明Fas信号通路参与其中。此外,硫链丝菌肽下调FoxMl还导致IAP蛋白家族中cIAP1、 XIAP和survivin表达水平降低,说明IAP蛋白家族也参与了该凋亡过程。5、硫链丝菌肽下调FoxM1抑制了Hep-2侵袭和迁移能力,并导致侵袭、转移因子MMP-2和MMP-9的表达下调。6、硫链丝菌肽下调FoxM1抑制了Hep-2细胞克隆形成能力。7、硫链丝菌肽下调FoxM1表达抑制了Hep-2细胞在裸鼠体内成瘤能力,并发现硫链丝茵肽作用后引起肿瘤组织中Ki67蛋白表达水平下降,cleaved caspase-3蛋白表达水平增加。8、成功构建稳定转染FoxM1shRNA Hep-2细胞株。RNA干扰下调FoxM1表达抑制了Hep-2细胞体外克隆形成能力,并抑制了Hep-2细胞在裸鼠体内生长能力。结论：1、硫链丝菌肽下调FoxM1抑制了喉癌细胞增殖,其机制可能通过阻滞细胞于S期,以及抑制细胞周期蛋白如cyclinD1和cyclinE1的表达。2、硫链丝菌肽下调FoxM1促进了喉癌细胞凋亡,其机制可能通过线粒体-caspase通路、Fas信号通路以及作用于IAP蛋白家族。3、硫链丝菌肽下调FoxM1抑制了喉癌细胞侵袭、转移以及克隆形成能力,机制可能通过下调MMP-2和MMP-9表达。4、硫链丝菌肽下调FoxM1抑制了喉癌细胞在体内的生长,其机制可能通过抑制细胞的增殖和促进其凋亡实现。5、RNA干扰下调FoxM1可抑制喉癌细胞体外克隆形成能力以及体内生长能力。
[Abstract]:......
【学位授予单位】：重庆医科大学
【学位级别】：博士
【学位授予年份】：2015
【分类号】：R739.65

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本文编号：1486964