LOX-1调控真菌性角膜炎中性粒细胞凋亡机制的研究

发布时间：2018-02-12 09:02

本文关键词： 真菌性角膜炎中性粒细胞凋亡小鼠　出处：《青岛大学》2017年硕士论文　论文类型：学位论文

【摘要】：目的:探究凝集素样氧化性低密度脂蛋白受体-1(lectin-like oxidized low density lipoprotein recepter-1,LOX-1)调控真菌性角膜炎中性粒细胞凋亡机制。方法:该实验分别在真菌性角膜炎小鼠体内动物模型和培养的小鼠腹腔提取中性粒细胞真菌刺激的体外细胞模型上研究调控真菌性角膜炎中性粒细胞凋亡机制。随机将健康的C57BL/6小鼠随机分为对照组和烟曲霉菌感染组,分别于0、1天、3天、5天观察小鼠角膜感染情况后处死小鼠,收集小鼠的角膜,采用qRT-PCR技术检测小鼠角膜中促进凋亡的基因Fas、FasL,Caspase-3、Caspase-8、Caspase-9mRNA和抑制凋亡的基因Bc L-2mRNA的表达情况,免疫荧光技术检测角膜中中性粒细胞的浸润和活化的Caspase-3蛋白的表达情况以及TUNEL技术检测角膜中细胞的凋亡情况。用LOX-1的中和抗体和IgG或LOX-1的抑制剂Poly I和PBS预处理,然后用烟曲霉菌菌丝去感染小鼠的角膜,分别在0、0.5天、1天、3天、5天观察小鼠角膜的感染情况后处死小鼠,收集小鼠的角膜,检测阻断和抑制LOX-1后小鼠角膜中促进凋亡的基因Fas、FasL,Caspase-3、Caspase-8、Caspase-9mRNA和抑制凋亡的基因BcL-2mRNA的表达情况,角膜中浸润中性粒细胞的染色和活化的Caspase-3蛋白的表达情况以及角膜中凋亡细胞的染色。从C57BL/6小鼠腹腔中提取分离中性粒细胞,烟曲霉菌菌丝刺激中性粒细胞0、4h、8h、12h、16h后观察细胞情况并收集细胞,采用qRT-PCR技术检测小鼠角膜中促进凋亡的基因Fas、FasL、Caspase-3、Caspase-8、Caspase-9m RNA和抑制凋亡的基因BcL-2m RNA的表达情况。从C57BL/6小鼠腹腔中提取分离中性粒细胞,用LOX-1的中和抗体和IgG或LOX-1的抑制剂Poly I和PBS预处理,烟曲霉菌菌丝刺激腹腔提取分离中性粒细胞8h,,运用qRT-PCR技术检测阻断和抑制LOX-1后中性粒细胞中促进凋亡的基因Fas、FasL、Caspase-3、Caspase-8、Caspase-9m RNA和抑制凋亡的基因BCL-2mRNA的表达情况,采用蛋白质印迹和流式细胞术检测中性粒细胞中活化的Caspase-3蛋白的表达情况以及中性粒细胞的凋亡情况。结果:感染C57BL/6小鼠角膜与正常角膜相比,促进凋亡的基因Fas、FasL、Caspase-3、Caspase-8和Caspase-9mRNA的表达,浸润中性粒细胞数目,活化的caspase3蛋白和TUNEL-阳性细胞数目均显著增高,相反,凋亡抑制的基因BCL2mRNA的水平显著降低。采用LOX-1中和抗体和抑制剂Ploy I处理后,对比IgG或PBS对照组,C57BL/6小鼠角膜组织中Fas、FasL、Caspase-3、Caspase-8、和Caspase-9mRNA,浸润中性粒细胞数目,活化的caspase3蛋白质和TUNEL-阳性细胞的显着降低但BCL2mRNA水平升高。在小鼠腹腔提取分离中性粒细胞中,对比单纯未刺激组,烟曲霉菌菌丝刺激后促进凋亡的基因Fas、FasL、Caspase-3、Caspase-8、Caspase-9mRNA、和促进凋亡BCL-2mRNA的表达均增高,而且8h烟曲霉菌菌丝刺激后凋亡基因增高最显著。与中性粒细胞中的IgG或PBS处理后的对照组相比,用中和抗体或抑制剂PloyI处理后,Fas、FasL、Caspase-3、Caspase-8、Caspase-9mRNA的表达明显降低而BCL2mRNA表达增多,活化的caspase3蛋白,和凋亡的中性粒细胞显着减少。结论:在烟曲霉菌感染小鼠角膜或刺激小鼠腹腔提取分离中性粒细胞后中性粒细胞的凋亡增高,而抑制LOX-1可以减少烟曲霉菌感染的小鼠角膜中性粒细胞的促凋亡的基因和抗凋亡基因,半胱天冬酶-3激活和中性粒细胞细胞凋亡。说明LOX-1抑制是通过减少Fas和Fas配体的结合,增加BCL-2的表达以及抑制炎症中半胱氨酸蛋白酶级联的活化,从而抑制胞内信号级联并减少中性粒细胞凋亡。
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【学位授予单位】：青岛大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2017
【分类号】：R772.21

【参考文献】