玉米黄素对人葡萄膜黑色素瘤细胞凋亡和迁移的作用及其机制研究

发布时间：2018-02-23 22:19

  本文关键词： 玉米黄素 葡萄膜黑色素瘤细胞 凋亡 迁移 侵袭　出处：《吉林大学》2016年博士论文　论文类型：学位论文

【摘要】：葡萄膜黑色素瘤(Uveal melanoma,UM)是一种最常见的成人眼内原发肿瘤。据报道,美国UM每年的发病率为6-7例/百万人。UM的生存率极低,约一半的患者在确诊后25年内死亡。UM的高死亡率与肿瘤的组织转移密切相关,其中以肝转移最为常见。大多数UM伴随肝转移的患者在6个月内死亡。由于转移性的UM患者预后较差,急需新的治疗方法以提高患者的生存率。玉米黄素(Zeaxanthin)是一种类胡萝卜色素,属于叶黄素类。在多种食物(蛋黄、玉米、蔬菜和水果),草本植物,传统中药(沙棘、枸杞、百合、苏铁、番红花)中含有很高的含量。已有研究发现不同恶性肿瘤的发病率与饮食或血液中玉米黄素含量有一定的关系。流行病学研究表明,多种恶性肿瘤的发生风险降低可能与高摄入量和血液中高含量的玉米黄素有关,包括非霍奇金淋巴瘤,宫颈癌,食管癌,胃癌,肺癌,乳腺癌,肾脏肿瘤,头颈部肿瘤,结肠癌和胰腺癌。但玉米黄素对不同肿瘤细胞作用的体外研究只有极少数,且都仅局限于几类癌细胞株,包括淋巴瘤,乳腺癌,结肠癌和神经母细胞瘤。这些研究表明玉米黄素可能抑制癌细胞增殖或诱导癌细胞凋亡,但其诱导肿瘤细胞凋亡的具体机制尚无报道。目前尚无玉米黄素的摄入量与血液中的含量与UM发病率之间的关系、玉米黄素诱导UM细胞的凋亡作用和途径以及玉米黄素对UM细胞的迁移和侵袭作用及其机制的任何研究报道。目的:本实验通过研究玉米黄素对人葡萄膜黑色素瘤细胞的凋亡作用及其相关途径,以及玉米黄素对转移性UM细胞迁移和侵袭的作用及其相关机制的研究,为玉米黄素用来治疗葡萄膜黑色素瘤甚至其他恶性肿瘤提供理论基础。方法:三种正常细胞(葡萄膜黑色素细胞、成纤维细胞及视网膜色素上皮细胞)和两种葡萄膜黑色素瘤细胞(SP6.5和C918)与不同浓度(10,30,100和300μM)的玉米黄素培养。分别用MTT法检测玉米黄素对细胞活性的影响,流式细胞仪检测细胞的凋亡,Western Blot法检测Bcl-2家族蛋白的表达情况,JC-1染色后检测细胞膜电位(MTP)的改变,ELISA法分别检测细胞色素c和Casepase-3、8、9的表达。细胞划痕实验和Boydon小室迁移实验法检测C918的迁移情况,Matrigel侵袭实验检测玉米黄素对细胞的侵袭作用,ELISA法检测MMP-2蛋白和NF-κB的分泌情况。结果:不同浓度的玉米黄素(10,30,100和300μM)对人正常葡萄膜黑色素细胞、视网膜色素上皮细胞及成纤维细胞三种细胞的活性均无明显影响。玉米黄素显著降低SP6.5和C918两种葡萄膜黑色素瘤细胞的活性,并呈剂量依赖效应。流式细胞仪检测结果为与对照组相比,玉米黄素能显著增加葡萄膜黑色素瘤细胞的凋亡率(P0.05)。30μM的玉米黄素可显著降低SP6.5的抑制凋亡蛋白Bcl-x L和Bcl-2的表达,增加促凋亡蛋白Bak的表达;降低C918的抑制凋亡蛋白Bcl-x L的表达,增加促凋亡蛋白Bax的表达(P0.05)。用30μM玉米黄素培养的C918以绿色荧光为主,MTP被损害。C918用玉米黄素培养后与对照组相比,细胞色素c、Caspase-3和Caspase-9的水平显著增加(P0.05),而Caspase-8的水平无明显变化。同对照组相比,3和10μM玉米黄素组迁移和侵袭的UM细胞数均显著减少,C918分泌MMP-2的水平以及细胞核提取物中NF-κB的含量均显著降低(P0.05)。结论:浓度为10-100μM的玉米黄素能选择性地降低葡萄膜黑色素瘤细胞的活性,但对正常组织细胞(葡萄膜黑色素细胞、成纤维细胞和视网膜色素上皮细胞)活性即使在较高浓度300μM时仍无明显影响,表明玉米黄素对葡萄膜黑色素瘤细胞有特异性。同非转移性黑色素瘤细胞SP6.5相比,玉米黄素对转移性C918的细胞毒性更为敏感,这表明玉米黄素有可能成为预防和治疗转移性葡萄膜黑色素瘤的新药。通过流式细胞仪检测发现用玉米黄素培养的细胞同对照组相比被annexin(表明凋亡变化)染色细胞明显增多,且随着时间增长细胞凋亡率增加,表明玉米黄素可以诱导UM细胞的凋亡。玉米黄素诱导凋亡是通过调节Bcl-2家族蛋白的细胞内凋亡途径。通过JC-1染色法发现玉米黄素可显著增加线粒体外膜的通透性,使细胞色素c从线粒体释放到细胞质中,显著增加细胞质中的细胞色素c含量,从而激活Caspase-9和Caspase-3,最终引起细胞凋亡,表明玉米黄素主要通过细胞内线粒体途径诱导UM细胞凋亡。非致死剂量的玉米黄素通过NF-κB通路来抑制MMP-2的分泌,从而进一步引起玉米黄素抑制UM细胞的迁移和侵袭。综上,玉米黄素可能是一种潜在的治疗和预防葡萄膜黑色素瘤的新药。
[Abstract]:Uveal melanoma (Uveal melanoma UM) is one of the most common adult primary intraocular tumor. According to reports, the United States UM annual incidence rate was 6-7 cases per million.UM survival rate is very low, the high mortality rate is closely related with tumor.UM in about half of the patients died within 25 years after diagnosis the transfer of tissue, with liver metastasis is the most common. Most UM with liver metastasis patients died within 6 months. Due to the transfer of UM patients with poor prognosis, urgent need of new treatment methods to improve the survival rate of patients. Zeaxanthin (Zeaxanthin) is a species of carotene, lutein is in a variety of. The food (egg yolk, corn, vegetables and fruits), herbs, traditional Chinese medicine (sea buckthorn, wolfberry, lily, cycas, saffron) contains high content. The research found that there were some different incidence of cancer and diet or blood corn content of emodin 绯，

本文编号：1527844