视网膜色素变性及正常小鼠视锥细胞中mTOR通路作用的研究

发布时间：2018-02-27 07:16

  本文关键词： 视锥细胞 视网膜色素变性 PI3K/AKT mTOR 神经保护作用　出处：《天津医科大学》2015年博士论文　论文类型：学位论文

【摘要】：目的光感受器细胞是人体内代谢最为活跃的细胞之一,其代谢的平衡主要依赖于细胞内PI3K/AKT/m TOR调节通路。近年来研究显示,光感受器细胞代谢失衡所引起的细胞自噬可能与多种眼底变性疾病的发生与发展密切相关。本研究聚焦于对人类视觉质量至关重要的视锥细胞,通过对其特异性敲除m TOR通路中PTEN、TSC1、RAPTOR、RICTOR等若干重要的调节因子,观察视网膜色素变性及正常小鼠视锥细胞形态、及功能的改变,初步探讨m TOR通路在病变及正常视锥细胞中的调节作用。方法1.利用中波长视蛋白为启动子的M-Cre重组酶系统,建立视锥细胞特异性目标基因敲除小鼠种系:①目的基因的确立:通过敲除肿瘤抑制基因磷酸酶张力蛋白基因Pten实现对AKT/m TOR通路的持续性激活;通过敲除结节性硬化症复合物基因Tsc1,持续性激活m TORC1;通过敲除编码m TORC1复合物的重要组成RAPTOR蛋白的基因Raptor实现m TORC1功能缺失;通过敲除编码m TORC2复合物的重要组成RICTOR蛋白的基因Rictor实现m TORC2功能缺失;通过同时敲除Raptor及Rictor基因,实现m TORC1及m TORC2功能共同缺失。②将表达M-Cre的小鼠与携带目的基因Lox P位点的C57Bl6小鼠杂交以获得正常视锥细胞特异性目标基因敲除小鼠系Targetc/c,MCre+(Targetc KO)及其对照组Targetc/c,MCre-。③将Targetc/c,MCre+小鼠与Pde6b / (rd1)视网膜色素变性小鼠进行杂交,以获得有视网膜色素变性背景的视锥细胞目标基因敲除小鼠系rd1,Targetc/c,MCre+(rd1_Targetc KO)及其对照组。④双基因敲除小鼠种系的建立:经多次杂交获得Target1c/c,Target2c/c,MCre+;rd1,Target1c/c,Target2c/c,MCre+及其相应对照组小鼠。⑤视紫红质基因敲除小鼠(Rho-/-)用于验证本文阐述的机制是否适用于其他视网膜色素变性模型。2.鼠尾组织DNA提取物PCR用于小鼠基因型的鉴定。3.表达td Tomato自发荧光蛋白的Ai9 Cre报道基因系用于验证MCre+视锥细胞在全视网膜中均匀分布。4.视网膜平铺片和/或冰冻切片免疫组织化学染色,检测视锥细胞形态、存留率、视锥细胞特异性蛋白表达量及AKT/m TOR通路中相关蛋白表达量的改变。5.Western Blot免疫印迹法用于定量检测目的基因敲除组AKT/m TOR通路中相关蛋白表达量的改变。6.实时定量PCR(q RT-PCR)用于检测AKT/m TOR通路中相关基因含量的改变。7.全视网膜组织NADPH定量分析技术用于检测rd1,Tsc1c/c,MCre+及其对照组小鼠视网膜中NADPH水平。8.对rd1小鼠敲除Casp2基因,以验证NADPH水平对疾病状态下视锥细胞的重要性。9.明视视网膜电图(Photopic Electroretinogram,photopic ERG)用于对视锥细胞功能进行检测。10.眼底照相用于观察各组小鼠眼底大体情况。11.扫描电镜用于观察各组小鼠光感受器细胞层及视网膜色素上皮层区域超微结构的改变。结果I.成功建立各基因敲除小鼠系;MCre视锥细胞在全视网膜均匀分布。II.视网膜色素变性小鼠组1.视网膜平铺片联合视锥细胞特异性蛋白免疫组化染色,视锥细胞计数结果显示:①rd1_Ptenc KO小鼠视锥细胞存留率于出生后2月、4月、8月均显著高于对照组(p0.05);出生后2个月rd1_Ptenc KO,Raptorc KO及rd1_Raptorc KO小鼠视锥细胞存留率均明显低于对照组(p0.05);rd1_Rictorc KO小鼠视锥细胞存留率仍高于对照组(p0.05);②rd1_Tsc1c KO小鼠视锥细胞存留率于出生后2月、4月、8月均显著高于对照组(p0.05);出生后2个月rd1_Tsc1c KO,Raptorc KO小鼠视锥细胞存留率均明显低于对照组(p0.05);rd1_Tsc1c KO,Rictorc KO小鼠视锥细胞存留率仍高于对照组(p0.05)。2.明视ERG结果:出生后21天及2个月rd1_Tsc1c KO小鼠视锥细胞功能均显著高于视网膜色素变性对照组(p0.05)。3.视网膜平铺联合AKT/m TOR通路相关磷酸化蛋白免疫组化染色显示:①rd1,Ptenc/c,MCre+小鼠视网膜p-AKT-Thr308、p-S6阳性视锥细胞数明显高于对照组;p-AKT-Ser473、p-SGK-1阳性视锥细胞数低于对照组;②rd1_Tsc1c KO小鼠p-S6阳性视锥细胞数明显高于对照组,且与rd1_Ptenc KO小鼠视网膜相比p-S6阳性视锥细胞更广泛和均一。4.视网膜平铺联合细胞增殖标记蛋白Ki-67免疫组化染色显示:rd1_Tsc1c KO小鼠视网膜未见Ki-67Ki-67阳性细胞。5.视网膜平铺联合m TOR通路下游代谢相关蛋白免疫组化染色显示:与对照组相比rd1_Tsc1c KO小鼠视网膜中葡萄糖转运蛋白(GLUT1),己糖激酶-II(HKII),葡萄糖-6-磷酸脱氢酶(G6PD),丙酮酸激酶-2(PKM2),苹果酸脱氢酶-1(ME1),低氧诱导因子-1α(HIF-1α)等表达量均显著增加;在rd1_Tsc1c KO,Raptorc KO小鼠视网膜中未见上述蛋白表达量的增加。6.全视网膜组织NADPH定量分析显示:于出生后21天,rd1_Tsc1c KO小鼠视网膜NADPH含量显著高于对照组(p0.05)。7.q RT-PCR显示:与对照组相比,出生后21天rd1_Tsc1c KO小鼠视网膜中代谢相关基因Hif-1α,Glut-1,Hk II,G6pd,Pkm2,Me1等均有所增加,并于出生后24天呈现显著性差异(p0.05)。8.Casp2基因敲除延缓rd1小鼠视锥细胞死亡。9.于出生后30周,与对照组Rho-/-小鼠相比Rho-/-,Tsc1c/KO视锥细胞存留率显著提高(p0.05);p-S6阳性视锥细胞数高于对照组;代谢相关基因Hk II,Pkm2等表达量升高。III.正常小鼠组1.明视ERG结果显示与对照组相比,Raptorc KO小鼠及Rictorc KO小鼠视锥细胞功能自出生后4个有所下降后回升,至出生后1年未见显著异常。Raptorc KO,Rictorc KO小鼠视锥细胞功能自出生后2个月至1年持续显著下降(p0.05)。2.眼底照相结果:截止出生后1年,各组小鼠眼底无明显异常。3.视网膜冰冻切片免疫荧光组织化学染色结果:与对照组相比出生后1年Raptorc KO、Rictorc KO及Raptorc KO,Rictorc KO小鼠①视网膜视锥细胞特异性蛋白:中波长视蛋白,短波长视蛋白,视锥细胞视紫红质抑制蛋白,视锥细胞转导蛋白的表达量略有下降,但视锥细胞数量无显著区别;②腹侧视网膜中波长视蛋白表达量分别于3至5个月、4至7个月、2至3个月出现一过性减低;③光感受器细胞外节部分形态略显异常。4.电镜检查结果:半薄切片甲苯胺蓝染色显示与对照组相比,m TORC1缺失小鼠及m TORC2缺失小鼠视网膜整体结构并未出现明显改变。m TORC1缺失小鼠视锥细胞内节结构较为疏松、变薄;外节出现退行性改变。高倍电镜检查显示:m TORC1缺失小鼠部分视锥细胞内节扩张,伴或不伴有外节结构紊乱,内含多个空泡结构。结论1.持续性激活m TORC1活动是促进视网膜色素变性小鼠视锥细胞长期存活的必要且充分条件;m TORC2及AKT介导的促细胞存活调节机制在其中作用并不显著。2.m TORC1通过促进细胞葡萄糖摄取、蓄积以及增加磷酸戊糖途径代谢实现对视网膜色素变性小鼠视锥细胞的保护作用。3.正常小鼠视锥细胞的正常功能需要m TORC1及m TORC2同时具有活性。4.正常小鼠视锥细胞代谢、生长和存活的维持并不依赖于m TORC1和/或m TORC2,提示PI3K对细胞的促存活信号调节机制可能并不直接通过其下游的insulin/m TOR通路。
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本文编号：1541679