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Leber遗传性视神经病变线粒体DNA突变位点检测及发病机制研究

发布时间:2018-03-03 13:53

  本文选题:Leber遗传性视神经病变 切入点:线粒体DNA突变 出处:《南方医科大学》2012年博士论文 论文类型:学位论文


【摘要】:研究背景: Leber遗传性视神经病变(Leber's Hereditary Optic Neuropathy, LHON)是-种因线粒体功能障碍所导致的母系遗传疾病,病变主要累及视盘黄斑束神经纤维。该病以双眼急性或亚急性中央视力丧失为主要特征,发病人群主要为年轻或成年男性。1871年,德国眼科医生Theodor Leber对16个家系的55例患者,进行调查研究后,首先报告了LHON病的临床特征,同时确认该病为一种独立的遗传性疾病。在疾病早期,患者大多表现为眼底视神经炎,所以称之为Leber视神经炎;但经过较长病程后,后期患者常表现为视神经萎缩,因此该病又被称为Leber视神经萎缩。LHON病的病理机制迄今为止并未完全阐明,先后有人提出X-连锁隐性遗传、常染色体显性遗传等观点,但均不能合理得解释LHON家系的发病特点和遗传规律。后来细胞质遗传学说较好的解释了该病的发病特点。1988年Wallace找到了细胞质遗传的物质基础,即线粒体DNA (mitochondrial DNA, mtDNA)突变,并首先报告了第一个与LHON相关的线粒体DNA突变位点11778, Wallace对9个家系进行了分子生物学检测研究后,证实了此位点位于ND4基因,并明确了线粒体DNA突变与LHON病的密切关系,从此为研究LHON的发病机制开辟了新的方向。人类完整的线粒体DNA (mtDNA)为一个包含有16569个碱基对的环状DNA分子,能够自我复制,是独立于核染色体之外的一个遗传系统。线粒体DNA的2条链,所含的碱基成分不尽相同,一条为轻链,另外一条为重链,但都具有基因编码功能:共编码2类rRNA、22种tRNA以及包含13条多肽链的mRNA(即细胞色素-B、-C,氧化酶的Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ亚单位,ATP酶亚单位-6、-8,以及NADH脱氧酶的7个亚单位:ND1、ND2、ND3、ND4、ND5、ND6、 ND4L)。由此可见,线粒体DNA的编码基因突变,必然导致细胞的氧化磷酸化过程发生障碍,导致细胞供能不足。在Wallace的研究基础上,1991年HuoponenK等对3个芬兰家系研究后,发现了位于ND1基因的3460突变位点;Johns DR等对来自于14个家系的先证者检查后,发现了位于ND6基因的14484突变位点[2-3]。G11778A、G3460A、T14484C作为LHON的原发突变位点已被众多学者们熟知,位于编码呼吸链复合物Ⅰ的基因序列,与临床中95%的LHON病例密切相关。在中国的LHON患者中,又以11778突变位点为主(90.9%),相比之下,3460及14484突变位点在我国的LHON患病人群中,所占的比例较低。之所以认为上述3个突变位点并非人群中的多态性,而是原发性突变位点(primary mutation),是因为这些位点单独存在即可导致患者出现LHON的临床症状。这些位点参与编码的呼吸链氨基酸,在种属进化过程中高度保守,并且正常人群中并不存在这些突变。目前已经证实,上述3种原发性突变位点以外的多种线粒体DNA的单碱基点突变与LHON发病相关,这些突变位点被称之为线粒体继发性突变位点,已发现了30多个,中国人中包括3394、9438、4216等;但3种线粒体DNA原发性突变位点(G3460A、G11778A、T14484C)是导致失明的危险因素。然而,在该病发生的性别偏倚、不完全外显性、病理机制等方面,仍存在很多疑问。例如,张清炯等的研究发现,中国人携带11778位点的家系成员中并非全部受累,仅有52.3%的男性和13.8%的女性出现临床表现。但是继发性突变位点,核基因背景以及单倍体型差别等理论均无法完全解释LHON的病因、临床表现以及不同家系中成员的发病特征差异。 因病因和确切的发病机制未完全阐明,迄今为止对于LHON尚无有效的防治措施。大量视功能严重丧失的患者亟待救治,更有大量的遗传高危人群企盼着有效的预防措施。通过对LHON的家系研究发现,相当多携带原发性突变位点的家系存在不完全外显性,并且相同突变位点的不同家系其外显率存在差异,而且家系间患者临床表现也存在相当大的差异。因此提示继基因突变之后,环境因素、基因修饰等因素在临床表现中被发现起着重要的作用,且仅存在线粒体DNA突变可能并不足以导致突变位点携带者发病,亦即可能存在一个触发因素即“二次打击”环节。如果该环节发生在家系成员出生以后,我们就有可能找到预防发病的措施;如果该环节发生在出生以前,我们也有可能找到治疗该疾病的有效手段。研究发现,LHON患者的视网膜神经节细胞的凋亡过程可能与Fas/FasL介导的凋亡信号转导途径有关。在Fas/FasL介导的凋亡信号转导途径中,Caspase-8是启动凋亡的因子,并参与到Fas介导或非Fas介导的凋亡过程中。因此我们推测,“二次打击”的环节可能与Caspase-8基因的表达相关,而在其转录、翻译至表达的过程中,Caspase-8基因的甲基化状态占有十分重要的地位。 最新的研究结果提示:在含最常见及最严重的LHON突变型G3460A、 G11778A cybrid(胞质杂种)细胞对Fas诱导凋亡的敏感性明显增高,cybrid细胞线粒体生成的reactive oxygen species (ROS)明显增多,而ROS直接参与了凋亡的发生。目前凋亡信号转导途径中了解得最为深入的是经典的Fas/FasL介导的凋亡信号转导途径。根据sFasL可以刺激细胞表面Fas受体启动细胞凋亡途径这一特性,本实验使用sFasL作为凋亡诱导物,与已进入细胞周期的外周血单个核细胞共培养,从而了解家系中患者、单纯携带者、正常成员及家系外对照组研究对象在相同凋亡诱导条件下其凋亡率有无差别,尤其是在家系患者与单纯携带突变位点但未发病者之间的差异性,从而为研究相同线粒体基因背景却发病状态不同这一问题,提供可能的依据。z-VAD-fmk作为一种不可逆的caspase8抑制剂,可以在蛋白水平抑制caspase8的酶活性。本研究根据其这一特性,结合前期实验结果将z-VAD-fmk预处理LHON患者外周血单个核细胞,并使用sFasL对细胞群诱导凋亡,分析细胞在z-VAD-fmk处理组与未处理组其凋亡率的差异,探讨caspase8抑制剂z-VAD-fmk在细胞凋亡过程中起到的可能作用,处理前后两个阶段凋亡率的差异性,寻找抑制细胞凋亡的有效手段,从而为探讨LHON遗传高危人群有效地防治手段提供思路。 研究目的: 1.对于来自中国江西的一个LHON大家系进行眼科检查及分子生物遗传学检测,了解该家系病患者线粒体DNA点突变的形式及遗传学特点,证实本研究提出的“二次打击学说”中的“第一次打击”的存在,也即针对3个原发性突变位点进行分析,探讨该家系中是否携带目前已知的线粒体DNA原发性突变位点。 2.检测LHON点突变携带但未发病家系成员、LHON患者、家系中未携带突变位点的成员和正常对照组(家系外未患此疾病人群)Caspase-8基因甲基化或去甲基化状态、Caspase-8蛋白质的表达,探讨Caspase-8基因去甲基化状态在这四组研究对象中有无差异,是否可能成为LHON发病的一个因素。 3.结合前期的研究成果,探讨四组研究对象其外周血淋巴细胞对sFasL诱导凋亡的反应性差异,并探讨z-VAD-fmk在抑制患者外周血单个核细胞凋亡率方面的作用。 研究方法: 1.眼科检查:先建立临床诊断标准,然后分别进行视力、眼压、裂隙灯生物显微镜、改良的定量Amlser方格、FM100-Hue色觉检查法、Humphrey750型视野计等视功能的对比研究,然后对研究对象扩瞳后用全视网膜镜、多功能眼底图象处理系统及OCT3检测脉络膜、视网膜组织结构的改变。 2.遵循知情同意原则,对家族内成员及家系外未患此疾病正常人群抽取其外周静脉血,分离淋巴细胞,分离外周血单个核细胞(PBMC,包括单核细胞和淋巴细胞),制备DNA,进行PCR扩增,产物纯化测序,鉴定线粒体DNA G3460A、 G11778A、T14484C等位点的突变。 3.根据前期实验结果,将下一步研究对象分为:家系人员LHON患病成员、突变基因携带但未发病成员和家系内未携带突变位点的正常成员及家系外正常人,根据入选标准对以上四组人群再次进行外周血采集,分离外周血单个核细胞(PBMC),提取细胞总蛋白,使用western-blot方法检测Caspase-8蛋白表达含量,比较四组人群的Caspase-8蛋白表达是否存在差异性。 4.循前述实验步骤,提取四组人群的外周血单个核细胞,提取各组人群的基因组DNA,亚硫酸氢钠修饰基因组DNA,进行Caspase-8基因甲基化PCR检测,根据结果分析四组人群中的Caspase-8基因甲基化程度差异。 5.在sFasL凋亡诱导处理各组研究对象后,分别测定四组研究对象的外周血单个核细胞的凋亡率,并比较组间差异。 6.对Leber遗传性视神经病变患病成员的外周血单个核细胞进行z-VAD-fmk预处理,并检测分析预处理组与未处理组在sFasL凋亡诱导处理后的细胞凋亡率,并比较组间差异。 研究结果: 1.家系中存在24名基因突变位点携带者,其中有11名患者,他们发病后的视力介于光感至0.01之间,其中10名患者的视力损害级别为极重度。LHON患者的平均发病年龄为24.36岁,其中最大发病年龄为50岁,最小发病年龄为8岁。而携带有突变位点但至今未发病的人群,平均年龄为40.38岁,其中最大年龄为72岁,最小年龄为5岁。LHON患者的发病年龄与突变位点携带者的年龄相比有统计学差异(t=2.102,P=0.049)。家系患者共同特点是以严重的视力损害为主,未发现合并其他眼科疾病以及耳聋、共济失调等神经系统合并症。仅一例双眼视力下降的时间间隔为一周,其余患者均为双眼同时渐进性视力下降,不伴眼痛等其他不适。本研究家系中所有患者的视力均低于0.01,且迄今为止未见任何视功能恢复情况。对患者进行双眼眼底荧光素血管造影检查,结果显示:双眼视盘盘面毛细血管始终未见荧光充盈,晚期仅见盘沿荧光着色,无荧光遮蔽、视网膜血管无渗漏,并未表现出病程早期典型的视神经乳头周围的浅层毛细血管扩张,视网膜血管迂曲扩张等症状,可能是因为病程较长视神经已萎缩所致。 2.经采集样本的72名母系家族成员中,有24名同时携带有G11778A和T14502C两个突变位点,其中的11名为LHON患者,11名LHON患者中男性10名,女性1名,男:女=10:1,其他13名携带者至今并未发病,其余家系成员以及对照组研究对象均未携带上述突变位点。所有研究对象中均未发现G3460A和T14484C两个突变位点。 3.对家系中LHON患病成员、携带突变基因但未发病成员和家系内未携带突变位点的正常成员及家系外正常人四组人群外周血单个核细胞(PBMC)进行Caspase-8蛋白western-blot方法检测,结果发现,四组组间存在差异(F=16.124,P=0.000),LSD法两两比较结果:LHON患病成员组caspase8表达水平较高,LHON患病成员caspase8蛋白条带与相应GAPDH条带灰度比值较其他三组升高显著(P=0.000),突变基因携带但未发病成员、家系内未携带突变位点的正常成员及家系外正常人三组人群caspase8蛋白条带与相应GAPDH条带灰度比值差异两两比较其差异均无统计学意义(P分别为0.514、0.506、0.988)。 4.对四组人群进行Caspase-8基因甲基化程度研究,结果显示:组间存在差异(X2=20.466,P=0.000),对资料进行两两比较,将检验水准调整为a=0.007,患病成员组Caspase-8基因非甲基化状态阳性率高于其余三组,组间差异显著,具有统计学意义(P分别为0.001、0.000、0.000)。 5. sFasL对单个核细胞的凋亡诱导作用的研究: 采用Annexin V-FITC和PI双染下流式细胞术,对经过sFasL诱导后的细胞进行凋亡水平定量检测,结果显示:采用sFasL诱导后,每个组单个核细胞的凋亡率与自身阴性对照样本相比均有增加(t=18.877,P=0.000)。四组研究对象细胞经sFasl诱导后凋亡率存在差异(F=3.024,P=0.036),LSD法两两比较结果:与突变基因携带但未发病成员、家系内未携带突变位点的正常人及家系外正常人这三组研究对象相比,家系内Leber遗传性视神经病变患病成员的单个核细胞经sFasl诱导后凋亡率升高显著(P分别为0.010、0.017、0.110)。但除去LHON患者的剩余三组研究对象,其在细胞凋亡率方面的差异无统计学意义(P0.05)。 6.通过z-VAD-fmk预处理后,对Leber遗传性视神经病变患者的外周血单个核细胞进行sFasL凋亡诱导后的凋亡率进行研究,结果发现:在sFasL的诱导下,与患者研究对象组的细胞凋亡率相比,在适当剂量的z-VAD-fmk干预下,患者研究对象组的同样细胞样本,其细胞的凋亡率降低,前后差异显著,其干预组与非干预组的凋亡率差异具有统计学意义(t=3.904,P=0.003) 研究结论: 1.该家系患病成员共同特点是以严重的视力损害为主,家系中携带者的突变位点为G11778A及T14502C,且迄今为止所有患者均未出现视力恢复情况,这一情况与国外对携带G11778A位点家系的报道相一致,即患者视力损害严重,恢复或好转者罕见,预后差。但在国内研究报告中,G11778A突变患者,其中52.1%发病视力介于0.01与0.1之间,30.3%视力高于0.1,最终恢复率可达6.8%。与以上研究相比,本研究家系在临床表现及疾病预后方面,较单纯携带11778位点的家系差,因此G11778A可能与T14502C位点存在一定的协同作用。 2.本研究结果显示本家系LHON的平均发病年龄为24.36岁,除两例患者发病年龄大于35岁,其余患者发病年龄与国外报告的15-35岁一致,家系患者性别比例男:女=10:1,存在严重的性别偏倚。不完全外显性是LHON疾病的重要特征,本家系的外显率为45.8%,即许多携带有基因突变位点的家系成员即使明显大于平均发病年龄但迄今并未发病。说明仅仅存在线粒体DNA原发性突变位点并不足以导致携带者发病,作为必要条件的“第一次打击”尚不充分,可能需要“二次打击”环节。同时“二次打击”与“第一次打击”互相之间应该具有足够强大的协同效应。 3.作为参与Fas介导及非Fas介导凋亡途径的Caspase-8,其在家系患者中外周血单个核细胞中蛋白表达明显高于单纯携带未患病者以及正常人群。有研究实验表明,与正常细胞相比,原有LHON病理性突变的细胞对Fas介导的凋亡更加敏感。这表明本家系中患者体细胞内的Caspase-8蛋白表达异常升高,可能与携带线粒体DNA突变位点的细胞,在病理条件下更容易发生细胞凋亡相关。 4.家系中LHON患病成员,Caspase-8基因非甲基化阳性率明显高于携带突变基因但未发病成员、家系内未携带突变位点的正常成员及家系外正常人三组研究对象。这表明由于Caspase-8基因甲基化状态很大程度上影响了基因的转录效率,从而Caspase-8基因甲基化状态可能成为导致携带LHON突变位点家系成员发病的一个重要因素。 5.家系中LHON患病成员的外周血单个核细胞,对sFasL凋亡诱导处理的敏感性明显高于携带突变基因但未发病成员、家系内未携带突变位点的正常成员及家系外正常人三组研究对象。结合“结论3”可以发现,同一家系在携带相同线粒体DNA突变位点的基础上,与单纯携带者相比,LHON患者组单个核细胞不仅在Caspase-8基因非甲基化阳性率上明显升高,而且在同样凋亡诱导的处理条件下,LHON患者组细胞凋亡率更高,因此可以推测Caspase-8基因甲基化状态可能是通过提高细胞对凋亡敏感性而使突变位点携带者发病。 6.通过z-VAD-fmk预处理,对sFasL诱导的LHON患者的外周血单个核细胞凋亡过程有保护作用,且作用显著,能够明显降低细胞在面对凋亡诱导处理时的凋亡率。
[Abstract]:......
【学位授予单位】:南方医科大学
【学位级别】:博士
【学位授予年份】:2012
【分类号】:R774.6

【参考文献】

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本文编号:1561303

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