超声辐照阳离子微泡介导内皮抑素基因治疗视网膜新生血管的实验研究

发布时间：2018-03-11 05:38

本文选题：普通脂质微泡　切入点：阳离子脂质微泡　出处：《重庆医科大学》2015年博士论文　论文类型：学位论文

【摘要】：第一部分普通脂质及阳离子微泡制备及性能检测目的构建普通脂质微泡(NMB)、阳离子微泡(CMB),并检测其基本物理特征；比较NMB和CMB携载内皮抑素质粒(pEZ-M46-ES)的能力。方法采用机械震荡法构建两种不同的脂质微泡,通过在成膜材料中加入DC-胆固醇(DC-cholesterol)使微泡表面带正电荷从而构建阳离子微泡(CMB),光镜下观察不同微泡基本形态,并检测其浓度、粒径、表面电位及载基因能力等基本特性。结果NMB、CMB均成功构建,光镜下大小均一,分散度较好；其表面电荷、粒径及浓度分别为+25.62±4.38 mV,1.64±0.28μm,4.16±0.18×109/ml。固定微泡的浓度为5×108/ml,两者的载基因量分别为2.01±0.74μg和19.02±0.76μg。结论NMB及CMB制备成功。第二部分超声辐照阳离子微泡介导内皮抑素基因转染人视网膜血管内皮细胞目的研究NMB、CMB携内皮抑素质粒在超声作用下转染HRECs细胞转染效率,以及对细胞周期、体外血管成型及细胞迁移的影响。并与脂质体载体进行对比。方法实验分组：①空白对照组(C)②质粒+普通离子微泡+超声辐照组(NMB)③质粒+脂质体组(L)④质粒+阳离子微泡+超声辐照组(CMB)。①组以空白对照组,②组以超声辐照普通微泡介导内皮抑素基因转染作为阳性对照,③组以脂质体2000介导基因转染作为阳性对照,④组以超声辐照阳离子微泡介导内皮抑素基因进行转染。超声(1 MHz,1 W/cm2, and 50% duty cycle (DC),30 seconds)作用下转染HRECs,转染后收集细胞行流式细胞检测转染效率及细胞周期,qPCR及Western-blot分别检测endostatin, VEGF. bcl-2和bcl-xl mRNA及蛋白表达情况,通过体外血管成型及细胞迁移评价内皮抑素质粒在不同载体介导转染后的治疗效果。结果各组转染pEZ-M46-ES质粒后24h基因转染率分别为：1.20±0.21%,28.25±0.57%,30.74±7.50%和41.8±8.90%；转染后24h及48h流式细胞术检测细胞周期显示CMB组处于G1期的细胞较其他各组明显增多；MTT检测结果显示CMB组对HRECs的生长曲线较其他各组有明显抑制作用；qPCR及Western blot检测显示CMB组endostatin mRNA及蛋白表达较其他各组明显增加,而VEGF、bcl-2和bcl-xl的mRNA及蛋白表达较其他各组明显减少；各组HRECs形成网状新生血管的数量分别为26.47±3.52,15.17±1.52,13.19±3.43,8.42±1.02个；各组HREC细胞迁移数量分别为：30±1.57,22.4±2.07,21.6±2.17,15.4±2.7个。结论与普通脂质微泡和脂质体作为基因载体相比,CMB组基因转染效率明显提高；普通脂质微泡与脂质体也可增加基因转染效率,但两者基因转染效率无明显差别。超声辐照微泡介导内皮抑素基因转染HRECs,可明显抑制体外血管成型及细胞生长、增殖及迁移。第三部分内皮抑素基因对小鼠视网膜新生血管的抑制作用目的分别以脂质体、普通微泡和阳离子微泡作为基因载体,后两者联合超声辐照,介导内皮抑素基因转染小鼠视网膜,比较其抑制新生血管的效果并探讨其可能机制。方法分别将普通微泡,脂质体及阳离子微泡与pEZ-M46-ES质粒进行孵育,得到载基因的脂质体或微泡。采用高浓度氧诱导C57BL/6J小鼠建立OIR (Oxygen-inducedretinopathy,氧诱导视网膜病变)动物模型。将60只视网膜新生血管模型小鼠,随机分为以下3组：①质粒+普通离子微泡+超声辐照组(NMB)②质粒+脂质体组(L)③质粒+阳离子微泡+超声辐照组(CMB)。①组以超声辐照普通微泡介导内皮抑素基因转染,②组以脂质体2000介导基因转染,③组以超声辐照阳离子微泡介导内皮抑素基因转染。小鼠视网膜新生血管模型建造后用微量注射器按以上分组右眼玻璃体腔注射基因及载体复合物2μl,①、③组在注射后立即使用超声辐照眼球。左眼作为对照组(C)。于注射后5天行视网膜组织切片HE染色计数突破视网膜内界膜的血管内皮细胞核数目；注射后5、14、28d激光共聚焦显微镜下观察各组pEZ-M46-ES的荧光表达强度,qPCR法检测各组视网膜组织中endostatin、VEGF、bcl-2和bcl-xl mRNA的表达情况,Western blot法检测各组视网膜组织中endostati、VEGF、bcl-2和bcl-xl的蛋白表达情况。结果视网膜组织切片HE染色结果示CMB组小鼠突破视网膜内界膜的血管内皮细胞核数较其他各组显著减少,各组细胞核个数分别为：41.7±6.1,26.1±1.4,23.1±3.5,16.4±1.2个。激光共聚焦显微镜下观察并计算视网膜色素上皮层荧光强度所有数值的平均值,统计结果显示,转染后5及14d, NMB组、L组及CMB组的pEZ-M46-ES荧光表达强度均逐渐增强,转染后28d各组pEZ-M46-ES荧光表达强度较第14d减弱,CMB组与NMB组及L组相比有统计学差异；NMB组与L组在转染后5d及14d两组之间的荧光表达强度无明显统计学差异,但在转染后28d, NMB组的pEZ-M46-ES荧光表达强度较L组强,其差异具有统计学意义。视网膜组织qPCR及Western blot检测显示CMB组endostatin的mRNA及蛋白表达较其他各组明显增加,而VEGF、bcl-2和bcl-xl的mRNA及蛋白表达较其他各组明显减少。结论超声辐照阳离子微泡介导内皮抑素基因转染与普通微泡及脂质体相比可显著加强对小鼠视网膜新生血管生成的抑制作用。
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【学位授予单位】：重庆医科大学
【学位级别】：博士
【学位授予年份】：2015
【分类号】：R774.1;R450

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