鼻腔滴入慢病毒介导的MicroRNA-135a在变应性鼻炎中的作用及其机制
本文选题：变应性鼻炎 切入点：慢病毒 出处：《武汉大学》2016年博士论文
【摘要】：目的：探讨鼻腔滴入携带microRNA-135a (miR-135a)的慢病毒(lentivirus,Lv)在变应性鼻炎(allergic rhinitis, AR)小鼠中的作用及其机制。方法：采用卵清蛋白致敏BALB/c小鼠建立变应性鼻炎小鼠模型,生理盐水为对照组。采用慢病毒鼻腔给药系统,将Lv miR-135a应用于变应性鼻炎小鼠模型上。借助酶联免疫吸附试验(enzyme-linked immunosorbent assay, ELISA)检测血清中总IgE浓度,实时荧光定量逆转录聚合酶链反应(real-time quantitative reverse transcription polymerase chain reaction, RT-qPCR)检测小鼠鼻黏膜中miR-135a,转录因子(GATA binding protein3, GATA-3和T-box expressed in T cells, T-bet)的mRNA表达水平的变化,流式细胞术检测T-helper (Th)细胞极化情况,苏木精-伊红(hematoxylin and eosin, HE)及肥大细胞染色方法分析小鼠鼻黏膜嗜酸性粒细胞和肥大细胞的浸润情况,以及小鼠肺组织中炎性细胞的浸润情况,荧光双标免疫组化法检测Lv miR-135a在肥大细胞中共定位表达情况。并分别提取正常小鼠与变应性鼻炎小鼠的骨髓源肥大细胞(bone marrow mast cells, BMMCs)比较其miR-135a的表达情况。用SPSS19.0软件进行统计分析。结果：ELISA结果显示,与正常小鼠相比,变应性鼻炎小鼠血清总IgE浓度显著增加(P0.01),鼻腔滴入Lv miR-135a后血清总IgE浓度明显减少(P0.01)。鼻腔滴入Lv miR-135a有效下调了鼻黏膜中GATA-3的mRNA表达水平(P0.05), T-bet的mRNA和miR-135a表达水平显著升高(P0.05)。同时,流式细胞术结果显示鼻腔滴入Lv miR-135a有效调节了Th1/Th2的平衡。显微镜下观察到变应性鼻炎小鼠鼻黏膜嗜酸性粒细胞和肥大细胞明显高于正常对照组(P0.05),经鼻腔滴入Lv miR-135a后其数量明显减少(P0.05),同时,肥大细胞在鼻黏膜呼吸区上皮层和嗅区固有层分布明显较高。鼻腔滴入慢病毒后,肺组织无明显炎性细胞浸润。共聚焦显微镜下观察到鼻黏膜肥大细胞中有Lv miR-135a的表达。相比于正常小鼠来源的BMMCs, miR-135a在变应性鼻炎小鼠的BMMCs中存在差异性表达。结论：鼻腔滴入Lv miR-135a能安全有效地缓解小鼠变应性鼻炎的炎症反应,其机制可能是靶向调控了GATA-3的表达水平,从而影响肥大细胞活化。以鼻腔滴入Lv miR-135a为给药系统的治疗方法为慢病毒介导的microRNA治疗变应性鼻炎提供了实验参考及理论依据。
[Abstract]:Objective: to investigate the role and mechanism of nasal drip of lentivirus lentiviruslvus carrying microRNA-135a miR-135a in allergic rhinitis mice. Methods: an allergic rhinitis mouse model was established by using ovalbumin sensitized BALB/c mice. Normal saline was used as control group. Lv miR-135a was used in allergic rhinitis mouse model with lentivirus nasal delivery system. Serum total IgE concentration was detected by enzyme-linked immunosorbent assay (ELISAs) by enzyme linked immunosorbent assay (Elisa). Real-time quantitative reverse transcription polymerase chain reactionation (RT-qPCR) was used to detect the expression of miR-135a, GATA-3 and T-box expressed in T cells (T-bets) in mouse nasal mucosa. Hematoxylin and eosin (hehe) and mast cell staining were used to analyze the infiltration of eosinophils and mast cells in mouse nasal mucosa and the infiltration of inflammatory cells in the lung tissue of mice. The co-localization of Lv miR-135a in mast cells was detected by fluorescence double labeling immunohistochemical method. Bone marrow mast cells (BMMCs) from bone marrow derived from normal mice and allergic rhinitis mice were extracted to compare their miR-135a expression. SPSS19.0 soft was used to detect the expression of Lv miR-135a in mast cells. The results showed that the Elisa showed that, Compared with normal mice, The serum total IgE concentration of allergic rhinitis mice increased significantly (P 0.01), and the total serum IgE concentration decreased significantly after nasal drip of Lv miR-135a. Nasal drip of Lv miR-135a effectively down-regulated the mRNA expression level of GATA-3 in nasal mucosa (P 0.05), and the mRNA and miR-135a expression levels of T-bet increased significantly (P 0.05). The results of flow cytometry showed that nasal drip of Lv miR-135a effectively regulated the balance of Th1/Th2. Under microscope, it was observed that the eosinophil and mast cells in nasal mucosa of allergic rhinitis mice were significantly higher than that of normal control group (P 0.05), and Lv miR-135a was dripped through nasal cavity. At the same time, The distribution of mast cells in the upper cortex and olfactory lamina propria of nasal respiratory area was higher. The expression of LV miR-135a in mast cells of nasal mucosa was observed under confocal microscope. Compared with BMMC from normal mice, the expression of miR-135a was different in BMMCs of allergic rhinitis mice. It is concluded that nasal drip of Lv miR-135a can relieve the inflammatory response of allergic rhinitis in mice safely and effectively. The mechanism may be that the expression level of GATA-3 is regulated by targeting, thus affecting the activation of mast cells. The nasal drip of Lv miR-135a as the drug delivery system provides an experimental reference and theoretical basis for the treatment of allergic rhinitis with microRNA mediated by lentivirus.
【学位授予单位】：武汉大学
【学位级别】：博士
【学位授予年份】：2016
【分类号】：R765.21
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，本文编号：1693590
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