长链非编码RNA HNF1A-AS在鼻咽癌细胞增殖和转移中的作用研究

发布时间：2018-04-01 11:17

本文选题：长链非编码RNA　切入点：HNF1A-AS　出处：《吉林大学》2016年博士论文

【摘要】：目的:鼻咽癌是我国一种常见的头颈部肿瘤之一,起病隐匿,大多数患者发现较晚,预后不好。对鼻咽癌的治疗以放疗为主,尽管在治疗手段上有一定的进展,但是对于患者5年生存率来说,并没有显著提高。至今,鼻咽癌的发病机制仍然不够明确。长链非编码RNA对于生命活动具有重要的调节功能,我们主要研究长链非编码RNA HNF1A-AS与鼻咽癌之间存在什么样的关系。研究HNF1A-AS在鼻咽癌中的表达变化,证明HNF1A-AS具有促进鼻咽癌细胞增殖、迁移和侵袭的作用,并进一步研究鼻咽癌细胞获得迁移和侵袭能力与HNF1A-AS的关联。方法:首先,取20例鼻咽癌患者的肿瘤组织作为实验组,取其邻近的正常组织作为对照组,我们通过定量逆转录聚合酶链反应(q RT-PCR)来检测实验组和对照组中HNF1A-AS的含量。在人体组织中得出结果后进而在细胞水平进一步研究。培养鼻咽癌细胞系5-8F,6-10B,HONE-1,CNE-2,SUNE-1和C666-2作为实验组,人鼻咽上皮细胞NP69作为非癌性细胞对照组,进行q RT-PCR实验,在细胞水平证明HNF1A-AS在癌细胞和对照组中的表达变化。选取变化最大的两种细胞系CNE-2,SUNE-1进行后续实验。设计靶向干扰HNF1A-AS序列的si RNA作为实验组,选取RNA干扰实验常用的阴性对照序列作为对照组(scrambled si RNA)。我们将携带了HNF1A-AS-si RNA(以及scrambled si RNA)的慢病毒载体进行包装、纯化,并进行了病毒滴度测定。将携带了HNF1A-AS-si RNA(以及scrambled si RNA)的慢病毒载体转染到CNE-2,SUNE-1细胞中。进行q RT-PCR实验来检测转染成功后的细胞株中HNF1A-AS的表达变化。再继续将对实验组和对照组进行HNF1A-AS功能研究的实验。通过细胞增殖能力(MTT)、克隆形成能力实验、细胞划痕实验、Transwell细胞迁移实验、Transwell细胞侵袭实验来研究HNF1A-AS对细胞增殖、迁移和侵袭能力的影响,再通过细胞周期实验来进一步研究HNF1A-AS在细胞增殖中的作用。将实验组和对照组的鼻咽癌细胞株接种到24只雄性小鼠,每周测量一次肿瘤体积,来研究HNF1A-AS对体外成瘤能力的影响。最后,通过免疫印迹分析来研究HNF1A-AS介导细胞迁移的可能作用机制。结果:肿瘤组织中的HNF1A-AS m RNA水平明显高于邻近非癌性组织,与对照组相比,鼻咽癌组织中HNF1A-AS平均水平高于非癌性组织3倍以上,P0.001。HNF1A-AS在鼻咽癌细胞系中均表达上调,在SUNE-1,CNE-2细胞中含量最高,HNF1A-AS在SUNE-1细胞中的水平增加了8倍,而在CNE-2细胞中表达更高,增加了9.2倍,p0.05(5-8F,HONE-1);P0.01(6-10B,CNE-2,SUNE-1,C666-1)。用携带并能稳定表达scrambled和特异性HNF1A-AS si RNA的慢病毒载体转染至CNE-2,SUNE-1细胞。荧光显微镜提示转染效率70%。q RT-PCR结果显示CNE-2,SUNE-1细胞中HNF1A-AS m RNA水平显著下降。在CNE-2细胞中,与对照组相比,HNF1A-AS-si RNA组的HNF1A-AS水平降低了76%,在SUNE-1细胞中HNF1A-AS的水平降低到14%,p0.01(CNE-2),p0.001(SUNE-1)。细胞增殖和克隆形成能力:MTT结果显示,第四天时CNE-2细胞的增殖速率降低了32.5%,而SUNE-1细胞在第三天时增殖速率降低了33.3%。HNF1A-AS干扰后增殖速率减慢。克隆形成实验显示HNF1A-AS-si RNA组能抑制CNE-2,SUNE-1细胞系克隆形成。量化结果显示,在CNE-2细胞中,在scrambled si RNA(对照组)处理组中,约形成了70个集落,而在特异性si RNA处理组的中仅观察到21个集落;同样,在SUNE-1细胞中,在scrambled si RNA处理组中,约形成了60个集落,而在特异性si RNA处理组的中仅观察到19个集落,p0.01(CEN-2,SUNE-1)。细胞划痕和细胞迁移侵袭能力实验:HNF1A-AS被干扰后,CNE-2,SUNE-1细胞的迁移能力受到抑制。在CNE-2细胞中,scrambled组长满了划痕面积的67%,而HNF1A-AS-si RNA组仅长了44%;在SUNE-1细胞中,scrambled对照组长满了划痕面积的51%,而HNF1A-AS-si RNA组仅长了25%,p0.01(CEN-2,SUNE-1)。transwell定量实验显示,CNE-2细胞迁移到下室的数量降低了66.7%,SUNE-1细胞迁移到下室的数量降低了62.5%。侵袭实验结果显示,CEN-2,SUNE-1两种细胞的迁移数量与对照组相比分别降低了69.6%,62.5%,p0.01(CEN-2,SUNE-1)。细胞周期实验:在CNE-2细胞中,HNF1A-AS干扰使G0/G1期细胞数量增加了1.5倍左右,但却使S期和G2/M期的细胞数量分别降低了65%和66.7%。同样,HNF1A-AS-si RNA处理组的SUNE-1细胞中超过25.7%的S期和G2/M期细胞转移至G0/G1期,p0.01(CEN-2,SUNE-1)。鼻咽癌模型小鼠实验:我们每周对小鼠肿瘤体积进行测量,发现从第三周起HNF1A-AS-si RNA和对照组的肿瘤体积存在很大的差别,注射CNE-2细胞的小鼠肿瘤体积在第三周和第四周分别降低了58.8%和64%;相似的结果在注射SUNE-1细胞的小鼠中也有体现,与对照组相比,HNF1A-AS-si RNA的肿瘤体积在第三周和第四周分别降低了54%和69.7%,p0.05(CEN-2,SUNE-1)。免疫印迹分析:CNE-2,SUNE-1细胞中,HNF1A-AS干扰使上皮细胞-间充质转化(EMT)的标志性信号因子Cd C25C,cyclin B1,Snail,N-cadherin,vimentin表达明显受到抑制,E-cadherin表达增加。结论:HNF1A-AS在鼻咽癌组织及细胞系中均过表达。HNF1A-AS干扰可抑制细胞增殖和克隆形成还能抑制细胞迁移与侵袭。HNF1A-AS干扰可引起鼻咽癌细胞周期停滞在G0/G1期。HNF1A-AS干扰抑制鼻咽癌模型鼠的肿瘤生长。HNF1A-AS敲干扰可逆转EMT过程。综上所述,长链非编码RNA HNF1A-AS与鼻咽癌细胞增殖,迁移和侵袭密切相关,其引起细胞迁移和侵袭的作用的机制可能是参与到了EMT过程有关。这就提示我们通过对长链非编码RNA HNF1A-AS进一步的研究来为鼻咽癌的诊断和治疗提供新的方向。
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【学位授予单位】：吉林大学
【学位级别】：博士
【学位授予年份】：2016
【分类号】：R739.63

【参考文献】