靶向鼻咽癌细胞的壳聚糖复合纳米基因载体的研究

发布时间：2018-04-03 11:07

本文选题：肿瘤基因治疗　切入点：聚乙烯亚胺　出处：《吉林大学》2012年硕士论文

【摘要】：恶性肿瘤是当今社会影响人类健康的主要疾病。近年来，随着人们对肿瘤发生发展等相关分子机制的深入研究，肿瘤的基因治疗受到了越来越多的关注。肿瘤基因治疗的核心问题是如何将治疗基因安全高效的运输到靶器官和靶细胞。因此，基因传递载体的选择至关重要。目前广泛应用于肿瘤基因治疗的递送体系有病毒载体和非病毒载体两类。其中，病毒类载体具有较高的转染效率，但存在一定的安全隐患，如病毒基因致病或诱发人体过激免疫反应等；另外病毒载体自身很少具有对肿瘤细胞的识别能力，有将治疗性基因大量带入正常细胞的风险。相对于病毒载体，非病毒载体的转染效率偏低，但由于其具有较好的安全性和易修饰性等特点，被寄予厚望。阳离子多聚物载体作为结构灵活，易于合成和改性，可引入特异靶向基团修饰的非病毒载体备受关注。其中，聚乙烯亚胺（PEI）是一种常用的体外阳离子转染试剂，能够通过“质子海绵”效应促进DNA溶酶体逃逸，其特点是转染效率高，但细胞毒性较大。壳聚糖（CS）是一种天然阳离子多糖，具有毒性低、生物相容性好、生物可降解、表面活性基团多等特点，但由其介导的转染效率相对较低。本文根据PEI和壳聚糖的各自特点，在壳聚糖基因传递体系中引入PEI分子，利用超分子组装的方法制备CS复合纳米基因传递载体，以提高CS载体的转染效率，对其制备处方进行优化，并在体系中引入可以靶向识别鼻咽癌细胞的小肽，，通过物理化学和细胞学手段评价新型载体的基本性能、基因转染效率、安全性。在上述基础上，本文还引入基因表达限制性调控元件，考察了载体携载该基因在肿瘤细胞中的表达特异性。具体内容主要包括以下几个方面： 1．壳聚糖复合纳米基因载体的制备及处方优化。通过对N/P比为1～10的PEI/DNA复合物进行表征，确定当N/P在6～10范围内，PEI/DNA复合物形态规则，粒径均匀；选取浓度为0.05%、0.1%、0.2%(w/v)壳聚糖溶液包裹PEI/DNA复合物，通过比较在CNE细胞中的luciferease表达量、MTT值来考察壳聚糖的浓度及PEI/DNA的N/P比对复合载体转染效率及安全性的影响，发现随着PEI量的增加，转染效率及细胞毒性都呈增加趋势，壳聚糖的加入可有效降低PEI的细胞毒性，最终获得了PEI、CS及DNA三者的最佳配比，即PEI/DNA的N/P=8，壳聚糖浓度为0.1%(w/v)。 2．靶向肽修饰壳聚糖复合纳米基因载体的制备及靶向性质考察。通过荧光显微镜技术观察发现靶向头颈癌细胞的12肽（TSPNHINGQKL）能够靶向识别鼻咽癌细胞（HNE-1、CNE）；通过化学方法，将靶向肽与壳聚糖共价偶联，制备靶向修饰的壳聚糖复合纳米基因载体；通过DNA保护、体外稳定性考察及细胞转染等试验证实该靶向复合纳米载体安全、稳定且转染活性不受体内环境（血清、酶）的影响，在HNE-1、CNE细胞中介导的表达显著提高，而在对照细胞（乳腺癌细胞ZR-75-30和人胚肺成纤维细胞MRC-5）中则无显著差别，可实现“载体转移靶向性”功能。 3．载体转移靶向和基因转录靶向双开关体系的构建。利用分子克隆等实验技术，在设计的表达基因中，引入基因表达限制性调控元件肿瘤特异survivin启动子，利用靶向壳聚糖复合纳米载体携载该基因构建载体转移靶向和基因转录靶向双开关体系，对该体系在HNE-1、CNE、ZR-75-30、MRC-5细胞中的表达情况进行考察，结果发现该体系只能在癌细胞内表达，在正常细胞中则无表达或低表达，并能选择性的在鼻咽癌细胞中高效表达；在表达基因中引入HSV-TK/GCV自杀基因系统，通过MTT法初步验证了靶向复合载体能够通过载体转移靶向及基因转录靶向两种方式，携载治疗基因进入鼻咽癌细胞并对细胞产生特异的杀伤和抑制作用。本文研究制备的鼻咽癌靶向壳聚糖复合纳米基因载体是一种高效、安全的非病毒载体，具备载体转移靶向和基因转录靶向双重靶向的功能，具有潜在的临床应用价值。
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【学位授予单位】：吉林大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2012
【分类号】：R739.63

【参考文献】