STGC3基因转录调控元件鉴定及功能位点分析

发布时间：2018-05-11 22:40

本文选题：鼻咽癌 + STGC3基因　；参考：《南华大学》2015年博士论文

【摘要】：[目的]运用生物信息学预测STGC3基因启动子,克隆并鉴定STGC3启动子;在此基础上,预测STGC3基因转录调控元件,分析并证实STGC3基因转录调控元件;进一步探讨STGC3基因相关转录因子对STGC3基因的转录调控作用。定点突变STGC3基因结构位点,通过检测基因突变后对鼻咽癌细胞生物学行为的影响,探讨STGC3基因发挥抑瘤作用的功能性位点,本研究为阐明STGC3基因的结构、功能及转录调控机制提供重要的实验依据。[方法]采用生物信息学预测并分析STGC3基因启动子区,克隆最有可能的启动子,构建双荧光素酶报告基因质粒,质粒经酶和测序鉴定,经脂质体瞬转至细胞,通过报告基因表达产物双荧光素酶活性检测,以鉴定STGC3基因启动子区。在启动子鉴定基础上,预测STGC3基因核心启动子区转录因子特异性结合位点,采用电泳迁移率变动分析法(EMSA)及染色质免疫共沉淀分析(Ch IP)法,验证转录因子特异性结合位点,从而明确该基因转录调控元件。采用RT-PCR和Western blot检测STGC3基因高表达的NP69细胞系和STGC3基因低表达的CNE2细胞系中Sp1的表达水平,然后运用RNAi技术干扰细胞中Sp1的表达,通过q RT-PCR和Western blot,分析Sp1低表达后对STGC3基因的影响,以验证转录因子Sp1的转录调控作用。针对STGC3基因糖基化位点(656 C)、蛋白激酶C磷酸化位点(725 C)和酪蛋白激酶Ⅱ磷酸化位点(913 T),3个可能性功能位点,运用Stratagene定点突变技术,对STGC3蛋白糖基化位点、蛋白激酶C磷酸化位点及酪蛋白激酶Ⅱ磷酸化位点分别进行单碱基定点突变,使656 C突变为G,725 C突变为T,913 T突变为G。构建带His标签的突变重组真核表达质粒,质粒经转化、抽提、酶切及测序鉴定,转染至鼻咽癌CNE2细胞系。通过RT-PCR和Western blot及免疫细胞化学从m RNA和蛋白质水平检测,得到稳定表达突变STGC3基因的CNE2细胞系。通过MTT和胎盼蓝染色细胞计数法检测STGC3基因突变对CNE2细胞生长增殖影响,采用流式细胞术检测STGC3基因突变对CNE2细胞周期以及凋亡影响,采用Western blot对凋亡相关蛋白Bax的影响,以明确STGC3基因的抑瘤功能位点。[结果]生物信息学结果显示,STGC3基因5’端上游的-3046bp至-46bp区域有启动子活性,在-2992bp至-69bp间启动子分值达0.8以上,其中-845bp至-795bp间分值最高,达到1.0。在-1140bp和-774bp处检测到GC盒信号,在-441bp处检测到CAAT盒信号。有两个Cp G岛:分别在-1805bp至-1705bp和-900bp至-684bp间;有两个转录起始位点:分别在-2348bp和-948bp处。经不同长度的片段缺失比对,取最有可能的283bp(-1360bp至-1077bp)、281 bp(-934bp至-653bp)和571 bp(-500bp至+72bp)启动子片段,构建p GL3-en283、p GL3-en281、p GL3-en571三种质粒,与阴性对照p GL3-enhance质粒相比,三种质粒均具有较强的启动子活性,三种质粒中以p GL3-en281质粒的启动子活性最强。认为-934bp至-653bp为STGC3基因核心启动子区。生物信息学结果显示,在STGC3基因核心启动子区-934bp至-653bp区域存在21个转录因子结合位点,其中9个为Sp1转录因子结合位点;当严格限定参数后,结果显示,基因核心启动子区域含有5个转录因子结合位点,其中Sp1转录因子结合位点2个。经EMSA和Ch IP实验证实,结果显示,STGC3基因中存在转录因子Sp1特异性结合位点,从而鉴定出STGC3基因转录调控元件。RT-PCR技术检测结果显示CNE2细胞组(1.12±0.05)中,转录因子Sp1在m RNA水平上,表达较NP69细胞组(0.33±0.02)明显升高,差异有统计学意义(P0.01)。Western blot结果显示,CNE2细胞组(2.67±0.28)中转录因子Sp1在蛋白水平上,表达高于NP69细胞组(1.17±0.17),差异具有统计学意义(P0.05)。说明转录因子Sp1有可能负调控STGC3基因。在此基础上,构建3个Sp1-sh RNA干扰质粒,经酶切及测序鉴定,结果显示,片段大小一致,序列正确,表明成功构建了Sp1干扰载体。Sp1-sh RNA干扰载体,经q RT-PCR及western blot筛选。筛选出干扰效率高的Sp1-sh RNA载体,转染至Sp1高表达的CNE2细胞系,q RT-PCR及western blot检测STGC3基因表达,结果显示CNE2细胞系中,干扰Sp1表达后,STGC3表达增高。突变质粒经酶切和测序鉴定,酶切结果显示目的片段大小一致,测序结果显示序列正确,成功构建三个突变型(His-STGC3-C656G、His-STGC3-C725T和His-STGC3-T913G)真核表达质粒。转染至鼻咽癌CNE2细胞系,突变质粒经RT-PCR、Western Blot及免疫细胞化学结果显示,突变质粒均表达STGC3基因m RNA和His-tag-STGC3融合蛋白质,MTT和胎盼蓝染色细胞计数生长曲线结果表明,His-STGC3-C656G和His-STGC3-C725T突变组对细胞的生长增殖抑制能力降低,与野生型组比较,差异有统计学意义(P0.05);His-STGC3-T913G突变组不影响细胞生长增殖能力。流式细胞术检测结果显示,His-STGC3-C656G组(1.20%±0.13%)和His-STGC3-C725T组(1.50%±0.26%),细胞凋亡率降低,与His-STGC3组,差异有统计学意义(P0.05),三个突变组对细胞生长周期无影响。Western Blot对凋亡相关蛋白Bax检测,结果显示,His-STGC3-C656G和His-STGC3-C725T突变组Bax蛋白表达降低,与野生型His-STGC3组比较,差异有统计学意义(P0.05)。[结论](1)-2992bp至-69bp为STGC3基因的启动子区,-934b至-653bp为其核心启动子区;(2)STGC3基因启动子区内有Sp1特异性结合位点,Sp1对STGC3基因表达起负调控作用;(3)STGC3基因656位C和725位C,是其重要功能性位点。
[Abstract]:Objective : To use bioinformatics to predict the STGC3 gene promoter , clone and identify the STGC3 promoter . On the basis of this , the STGC3 gene transcription regulatory element was predicted , and the transcription regulation of STGC3 gene was confirmed . The effect of STGC3 gene related transcription factors on the transcriptional regulation of STGC3 gene was further discussed . The transcription factors specific binding sites of STGC3 gene were determined by reverse transcription polymerase chain reaction ( RT - PCR ) and Western blot . The results showed that the promoter activity of transcription factor Sp1 was higher than that of the negative control p GL3 - en281 . The results showed that the transcription factor Sp1 was higher than that of NP69 cell group ( 1.17 卤 0.17 ) . The results showed that the transcription factor Sp1 was higher than that of NP69 cell group ( 1.17 卤 0.17 ) . The expression of STGC3 - C656G , His - STGC3 - C725T and His - STGC3 - T913G were detected by RT - PCR , Western Blot and Western blot . The results showed that there were significant differences in the expression of STGC3 - C656G , His - STGC3 - C725T and His - STGC3 - T913G .

【学位授予单位】：南华大学
【学位级别】：博士
【学位授予年份】：2015
【分类号】：Q78;R739.63

【参考文献】