AKR1B10表达参与鼻咽癌发生发展的分子机制研究

发布时间：2018-05-16 21:23

  本文选题：鼻咽癌 + 醛酮还原酶家族成员1B10　； 参考：《暨南大学》2016年博士论文

【摘要】：目的:鼻咽癌(Nasopharyngeal carcinoma,NPC)是好发于我国南方及东南亚地区最为常见的恶性肿瘤之一,其年发病率在30～80/10万,尤其以广东为甚。临床上鼻咽癌以高转移、高复发和低分化为显著特征,将近88.0%的鼻咽癌患者初诊时已有颈部淋巴转移,颈淋巴结转移被视为鼻咽癌发病的显著特征之一。鼻咽癌发生发展是一个多因素、多步骤的复杂过程,EB病毒感染及其他多种非病毒因素(如化学致促癌物)参与鼻咽癌发生、发展和转移。新近研究发现,醛酮还原酶家族1成员B10(AKR1B10,Aldo-keto reductase 1B10)在鼻咽癌发生、发展和转移中起促进作用,但AKR1B10参与鼻咽癌转移的确切分子机理仍不清楚。二亚硝基哌嗪(DNP,N,N'-Dinitrosopiperazine)是鼻咽癌非病毒因素(如化学致促癌物)的致病因子之一。前期研究发现,DNP通过活化多个信号分子,促进鼻咽癌细胞侵袭迁移,AKR1B10是其中的一个重要分子,推断DNP可以介导AKR1B10表达参与鼻咽癌转移。本文首先采用免疫组织化学和酶联免疫吸附的方法,分析了 AKR1B10在鼻咽癌组织和血清中的表达情况,从组织和血清学的层面明确AKR1B10表达与鼻咽癌发生发展及转移的关系。然后,应用分子克隆技术、基因转染技术、基因干扰技术、Real-time PCR技术和Western Blotting技术等探讨DNP对鼻咽癌细胞AKR1B10表达的影响,明确DNP上调AKR1B10表达促进鼻咽癌细胞的侵袭转移。最后,从细胞生物学功能角度进行研究,采用克隆形成试验、Transwell迁移和侵袭试验等考察DNP通过介导AKR1B10表达对鼻咽癌细胞生物学功能和行为的影响,从而阐明DNP可以诱导AKR1B10表达参与鼻咽癌转移的分子机制,为探讨鼻咽癌高转移的分子机理以及鼻咽癌筛查诊断的血清标志物、转移的检测和靶向治疗候选分子的筛选提供有价值的参考和依据。方法:(1)免疫组化检测鼻咽癌患者原发部位和有淋巴转移组织中AKR1B10蛋白表达水平,分析组织中的AKR1B10表达水平与鼻咽癌发生发展转移的关系。(2)ELISA法检测鼻咽癌无转移和有转移患者血清中AKR1B10的表达水平,明确AKR1B10血清学水平与临床鼻咽癌转移的关系。(3)用不同浓度DNP处理6-10B和5-8F细胞,MTT实验分析DNP对6-10B和5-8F细胞的非毒性浓度(NCC)和时效关系,确定DNP非毒性浓度。(4)分析DNP处理组和对照组细胞AKR1B10蛋白质表达的差异,明确DNP诱导AKR1B10表达。(5)应用分子克隆技术,构建AKR1B10过表达载体pcDNA3.1-AKRlB10,为后续研究做准备。(6)将过表达载体pcDNA 3.1-AKR1B10转染6-10B细胞,筛选稳定克隆株。1640培养基培养稳定细胞株,检测对照组和转染组之间AKR1B10蛋白质表达的差异,明确AKR1B10高表达对鼻咽癌细胞侵袭转移能力的影响。(7)细胞克隆形成试验、Transwell迁移与侵袭实验分析DNP诱导AKR1B10表达对6-10B和5-8F细胞迁移和侵袭能力的影响,明确DNP是否促进鼻咽癌细胞的运动迁移和侵袭。(8)采用siRNA干扰技术阻断6-10B和5-8F细胞AKR1B10的表达,分析DNP在AKR1B10表达被干扰后对鼻咽癌细胞的侵袭、迁移能力的影响,明确DNP通过介导AKR1B10表达促进鼻咽癌细胞侵袭转移。(9)实验结果和数据利用SPSS 19.0软件进行统计分析,选用非参数检验。结果:(1)免疫组织化学技术检测了 20例正常鼻咽黏膜上皮组织(NNET)、20例无淋巴结转移鼻咽癌组织(NPC,AJCC/UICC 2009分期)、30例有淋巴结转移鼻咽癌组织(LMNPC)中AKR1B10表达。结果显示AKR1B10在NNET、NPC及 LMNPC 组织的阳性率分别为 10.0%(2/20)、85.0%(17/20)、93.3%(28/30);AKR1B10在鼻咽癌中的表达明显高于正常鼻咽组织(P0.05),并且LMNPC组织中的表达高于无转移鼻咽癌组织,二者比较有差别意义(P0.05),提示AKR1B10表达升高与鼻咽癌发生发展有关,其表达上调与临床鼻咽癌发展转移正相关。(2)ELISA法检测鼻咽癌患者血清中AKR1B10水平,考察并明确血清AKR1B10水平与鼻咽癌发生发展及转移的关系。第一部分检测了 30例健康对照组、8例鼻咽炎症组、71例鼻咽癌组(不分期)血清中AKR1B10的表达情况,结果显示AKR1B10在健康对照组、鼻咽炎症组、鼻咽癌组中的中位数浓度分别为:62.73 ng/L、408.01 ng/L、603.52 ng/L。AKR1B10 在鼻咽癌和鼻咽炎症患者血清中均有表达升高,并且鼻咽癌组明显高于健康对照组和鼻咽炎症组(P0.05),提示AKR1B10血清水平与鼻咽癌发生发展呈正相关。第二部分检测了70例有明确临床分期(AJCC/UICC 2009分期)鼻咽癌患者血清标本中AKR1B10,其中无转移鼻咽癌患者3例,淋巴结转移鼻咽癌患者59例、远处转移鼻咽癌患者8例。三组血清AKR1B10的中位数浓度分别为:287.16 ng/L、482.08 ng/L、5878.21 ng/L,三组之间存在显著差异(P0.05)。结果提示,远处转移鼻咽癌患者AKR1B10的表达明显高于无转移和仅淋巴转移的病例(P0.05),淋巴结转移组高于非转移组(P0.05),提示AKR1B10血清学水平与临床鼻咽癌转移正相关,可以作为预测鼻咽癌转移的血清学候选标志物。(3)MTT实验结果表明,DNP在0～100μmol/L时,对6-10B细胞的生长没有明显影响(P0.05);在150μmol/L以上时,DNP对6-10B细胞生长增殖有明显的抑制作用,表现细胞毒性反应(P0.05)。0～100μmol/L是DNP处理6-10B细胞的非毒性浓度,而DNP对5-8F细胞的非毒性浓度则为0～150μmol/L,后续研究工作以100μmol/L作为DNP工作浓度。(4)细胞克隆形成实验结果表明,DNP处理组和对照组之间AKR1B10蛋白质表达和克隆形成数均存在差异,DNP处理组AKR1B10蛋白质表达高于对照组,克隆形成数也是DNP处理组多于对照组。(5)应用分子克隆技术成功构建了 AKR1B10过表达载体pcDNA 3.1(+)-AKR1B10。将表达载体 pcDNA3.1(+)-AKR1B10 转染 6-10B 细胞,Western Blotting分析显示对照组和转染组之间AKR1B10蛋白质表达存在差异(P0.05)。(6)Western Blotting分析DNP处理鼻咽癌细胞后AKR1B10的表达变化,结果表明用不同浓度的DNP处理6-10B细胞,AKR1B10的表达显著增强(P0.05),呈时间依赖性和剂量依赖性。(7)克隆形成、Transwell迁移和侵袭实验分析DNP对鼻咽癌细胞6-10B和5-8F迁移侵袭能力的影响。实验结果表明,DNP对6-10B细胞的运动迁移和侵袭能力起到明显增强作用;且阻断AKR1B10后,DNP诱导6-10B和5-8F细胞迁移侵袭的能力降低(P0.05)。(8)细胞免疫荧光结果显示:DNP介导6-1(B细胞AKR1B10表达以及5-8F细胞AKR1B10表达,蛋白表达主要定位于细胞浆。结论:(1)鼻咽癌组织和血清AKR1B10检测表明,颈部淋巴结转移和远处转移鼻咽癌患者的AKR1B10表达水平明显高于鼻咽癌未转移组和正常对照组,提示AKR1B10表达上调与临床鼻咽癌的发生发展及转移有关,可以作为鼻咽癌进展和治疗预后判断的候选标志物。(2)DNP通过介导AKR1B10高表达,增强鼻咽癌细胞侵袭和迁移能力。提示DNP作为化学致癌剂可能是鼻咽癌高转移重要的诱因之一。AKR1B10可能是鼻咽癌转移中一个重要的信号分子。(3)通过克隆形成试验、Transwell迁移、侵袭实验等细胞功能实验考察了DNP介导AKR1B10表达对鼻咽癌细胞生物学特性的影响,从而阐明DNP可以通过介导AKR1B10表达参与鼻咽癌的侵袭转移。(4)应用基因干扰技术、分子克隆技术、Real-time PCR技术以及Western Blotting等方法从基因和蛋白质水平研究并验证了阻断AKR1B10表达可以抑制鼻咽癌细胞的侵袭转移,提示AKR1B10可以作为鼻咽癌转移治疗的靶分子。
[Abstract]:Objective : Nasopharyngeal carcinoma ( NPC ) is one of the most common malignant tumors in the south of China and Southeast Asia , and its annual incidence is 30 锝，

本文编号：1898440