Eaf2通过Wnt信号通路抑制氧化应激诱导的人晶状体上皮细胞凋亡的研究

发布时间：2018-05-29 19:02

  本文选题：凋亡 + Eaf2　； 参考：《南方医科大学》2017年博士论文

【摘要】：1前言目前白内障患者导致的眼盲占全世界眼盲患者的50%,现在公认眼内晶状体受到氧化应激的损伤是白内障的主要原因。上皮细胞是氧化应激的主要目标。研究表明,过氧化氢诱导的氧化应激能够刺激人晶状体上皮(HLE)细胞凋亡,还有研究显示除了先天性白内障以外,其他各种类型的白内障发生的细胞学基础都被认为是和细胞凋亡有关。因此通过研究人HLE细胞凋亡的机制可能会为白内障防治提供更多理论依据。2目的研究在氧化应激诱导的HLE细胞的凋亡中Eaf2基因所起的作用和相关分子机制,并进一步探讨Eaf2基因如何通过抑制caspase-3活性、激活Wnt信号通路保护HLE细胞抑制过氧化氢导致的凋亡。3方法3.1细胞培养:在含20%FBS的MEM培养基中培养HLE-B3细胞。培养条件:5%CO2、饱和湿度、37℃。3.2过氧化氢诱导HLE-B3细胞凋亡:将HLE-B3细胞用50μM过氧化氢别处理 4h、8h和 12h。3.3载体构建和细胞转染:构建Eaf2的过表达,Eaf2基因的CDS全长被克隆并连接到pcDNA3.0载体;用Wnt3a干扰载体(Wnt3ashRNA)敲低Wnt3a,Wnt3ashRNA购自SantaCruz生物,同时匹配其NC,shCon(干扰载体空载)。确认Eaf2过表达的细胞,同时转染shWnt3a/shCon。3.4检测分析细胞凋亡:将过氧化氢处理HLEC-B3细胞后,用流式仪检测细胞,计算凋亡率。3.5 RNA提取和RT-PCR分析:采用TRIZOL法从细胞中提取总RNA,将RNA逆转成cDNA,用2-(?)Ct计算方法来比较各组间β-catenin,caspase 3,Eaf2,and Wnt3a mRNA的表达水平。3.6 免疫印迹分析:采用 western blot 检测 β-catenin,caspase 3,Eaf2,and Wnt3a 的蛋白水平。3.7免疫细胞化学:免疫荧光检测Eaf2和Wnt3a在细胞中的定位情况。4结果4.1.构建H202诱导的HLE细胞凋亡的模型。分别用50μM H2O2处理HLE细胞4、8、12小时后,凋亡细胞的比率均显著高于对照组(无H2O2处理组),并且凋亡率增加具有时间依赖性。RT-PCR和westemBlot结果均显示当细胞暴露于H2O2后,HLE-B3细胞中caspase 3mRNA和蛋白水平均明显上调,并且具有时间依赖性;Eaf2mRNA和蛋白水平显著下调,并且具有时间依赖性。4.2 Eaf2过表达抑制H2O2诱导的HLE细胞凋亡。Eaf2高水平过表达下,凋亡细胞的比例显著降低(p0.001),同时LDH释放量显著降低(p0.05)。RT-PCR和western blot分析显示Eaf2过表达的细胞中,凋亡相关蛋白caspase 3、Bax的mRNA和蛋白水平显著下调;Bcl-2的mRNA和蛋白达水平显著上调,说明Eaf2基因通过调节凋亡相关蛋白的表达而抑制过氧化氢诱导晶状体上皮细胞的凋亡。Eaf2过表达的细胞中Wnt3a和Wnt通路的关键蛋白β-catenin的mRNA和蛋白达水平均显著上调;Wnt通路中的抑制剂GSK3β蛋白水平明显下调,其磷酸化物p-GSK3β蛋白水平明显上调,提示Eaf2 and Wnt3a信号通路有密切的关系。免疫荧光也显示Eaf2过表达细胞中Eaf2和Wnt3a明显上调。4.3 Eaf2通过调控Wnt3a抑制HLE细胞中H202诱导的凋亡转染shWnt3a质粒干扰Wnt3a表达后,即使在Eaf2过表达情况下,HLE-B3细胞凋亡总比率仍显著增加,同时使已经被压抑的LDH释放量增加。RT-PCR和western blot显示Wnt3a敲低后caspase 3、Bax的mRNA和蛋白水平明显上调;Bcl-2的mRNA和蛋白水平明显下调,β-catenin、p-GSK3β的蛋白水平明显下调;GSK3β蛋白水平明显上调。说明Wnt3a被敲低后会影响到Eaf2对于HLE细胞的保护作用,Eaf2是通过调控Wnt3a抑制HLE细胞中H202诱导的凋亡。5.结论5.1 H2O2可以诱导晶状体上皮细胞发生凋亡。5.2在晶状体上皮细胞中可有效地转染Eaf20E质粒及shWnt3a质粒。5.3 Eaf2蛋白对过氧化氢诱导的晶状体上皮细胞的凋亡具有抑制作用。5.4第一次证明Eaf2基因转录产物可以保护HLE细胞免受暴露于过氧化氢导致的氧化应激损害。5.5 Eaf2通过调节凋亡相关蛋白(caspase 3、Bax、Bcl-2)的表达保护HLE细胞,抑制过氧化氢诱导的凋亡。6、Eaf2通过对Wnt3a信号通路的作用抑制过氧化氢导致的氧化应激损害。
[Abstract]:1 the eye blindness caused by cataract patients accounts for 50% of the patients with blind eye blindness at present. It is now recognized that the main cause of cataract is the damage of oxidative stress in the intraocular lens. The epithelial cells are the main target of oxidative stress. The study shows that oxidative stress induced by hydrogen peroxide can stimulate apoptosis of human lens epithelial (HLE) cells, and the results suggest that the oxidative stress induced by hydrogen peroxide can induce apoptosis of human lens epithelial cells. In addition to congenital cataracts, the cytological basis of various types of cataracts is considered to be associated with cell apoptosis. Therefore, the mechanism of apoptosis in human HLE cells may provide more theoretical basis for the prevention and treatment of cataracts based on.2 to study the Eaf2 gene in the apoptosis of HLE cells induced by oxidative stress. The role and molecular mechanism of the Eaf2 gene, and further explore how the Eaf2 gene can activate the Wnt signaling pathway to protect HLE cells by inhibiting the activity of Caspase-3, to inhibit the culture of.3 cell apoptosis induced by hydrogen peroxide: the culture of HLE-B3 cells in the MEM medium containing 20%FBS. Culture conditions: 5%CO2, saturated humidity, and 37 C.3.2 hydrogen peroxide induced HLE-B3 cell apoptosis: HLE-B3 cells were treated with 50 u M hydrogen peroxide with 4h, 8h and 12h.3.3 vector construction and cell transfection: the overexpression of Eaf2 was constructed. The CDS full length of the Eaf2 gene was cloned and connected to the pcDNA3.0 vector; Confirm Eaf2 overexpressed cells and transfect shWnt3a/shCon.3.4 to detect cell apoptosis: after treating HLEC-B3 cells with hydrogen peroxide, the cells were detected by flow cytometry,.3.5 RNA extraction and RT-PCR analysis were calculated: TRIZOL method was used to extract total RNA, RNA was reversed into cDNA, and 2- (?) Ct calculation method was used to compare each other. The expression level of beta -catenin, caspase 3, Eaf2, and Wnt3a mRNA was analyzed by.3.6 Western blot analysis, and Western blot was used to detect beta -catenin, caspase 3, Eaf2, and immunocytochemistry. The percentage of apoptotic cells was significantly higher than that of the control group (no H2O2 treatment group) after HLE cells treated with 50 M H2O2 respectively. The increase of apoptosis rate had time dependent.RT-PCR and westemBlot results all showed that when the cells were exposed to H2O2, caspase 3mRNA and protein levels in HLE-B3 cells were obviously up-regulated and time dependent. The Eaf2mRNA and protein levels were significantly down, and the time dependent.4.2 Eaf2 overexpressed H2O2 induced HLE cell apoptosis.Eaf2 high level overexpression, the percentage of apoptotic cells decreased significantly (p0.001), and the release of LDH decreased significantly (P0.05).RT-PCR and Western blot analysis showed the apoptotic phase in the expressed cells. The level of mRNA and protein of Bax, caspase 3, and protein level of Bcl-2 are significantly down regulated, and the level of mRNA and protein content of Bcl-2 is significantly up-regulated, indicating that the Eaf2 gene inhibits the mRNA and protein reaches of the key protein beta -catenin of the Wnt3a and Wnt pathway in the cells of the lens epithelial cells by the regulation of the expression of apoptosis related proteins. The level of GSK3 beta protein in the Wnt pathway was obviously down, and the level of the phosphorylated p-GSK3 beta protein was obviously up-regulated, suggesting a close relationship between the Eaf2 and Wnt3a signaling pathway. The immunofluorescence also showed that Eaf2 and Wnt3a obviously up.4.3 Eaf2 in the Eaf2 overexpressed cells were induced by regulating the induction of Wnt3a inhibition cells. After the apoptosis transfected shWnt3a plasmid interfered with Wnt3a expression, the total apoptosis ratio of HLE-B3 cells increased significantly even in the Eaf2 overexpression, and the increased LDH release of the already suppressed.RT-PCR and Western blot showed caspase 3 after Wnt3a knocking down, Bax mRNA and protein levels were obviously up-regulated. The protein level of beta -catenin, p-GSK3 beta was obviously down, and the level of GSK3 beta protein was obviously up-regulated. It indicated that Wnt3a was knocked down to affect the protective effect of Eaf2 on HLE cells. Eaf2 was the conclusion that Wnt3a inhibited the.5. apoptosis of H202 induced H202 in HLE cells, and the apoptosis of lens epithelial cells could be induced in lens epithelial cells. The Eaf20E plasmid and shWnt3a plasmid.5.3 Eaf2 protein could be effectively transfected to the apoptosis of the lens epithelial cells induced by hydrogen peroxide..5.4 first demonstrated that the Eaf2 gene transcription products could protect HLE cells from oxidative stress damage caused by hydrogen peroxide, and.5.5 Eaf2 by regulating apoptosis related proteins (caspase) (caspase) The expression of 3, Bax, Bcl-2) protects HLE cells and inhibits the apoptotic.6 induced by hydrogen peroxide. Eaf2 inhibits oxidative stress induced by hydrogen peroxide through the role of Wnt3a signaling pathway.
【学位授予单位】：南方医科大学
【学位级别】：博士
【学位授予年份】：2017
【分类号】：R776.1

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本文编号：1952036