多西环素对体外培养的牛角膜肌成纤维细胞的生物学影响

发布时间：2018-05-31 10:19

  本文选题：角膜肌成纤维细胞 + 多西环素　； 参考：《广西医科大学》2012年硕士论文

【摘要】：角膜独特的解剖结构使其充当着眼睛的第一个折射媒介,完成了90%以上的屈光功能,对形成视觉极其重要,任何眼部疾患一旦影响了角膜的透明性即可造成视力障碍。因此,维持角膜的透明性是视力正常的重要保证。当角膜因各种内外因素(如炎症、感染、眼外伤、自身免疫性疾病或肿瘤等)损伤后,在愈合过程中常常因改变了角膜结构的有序性而导致角膜透明性的改变[1],促使角膜瘢痕的形成,从而影响视力。 Berryhill,B.L.、Wilson, S.E.、Netto, M.V.等在相关研究中证实角膜基质细胞向肌成纤维细胞的表型转化是角膜瘢痕形成的主要机制,在细胞转化过程中各种细胞因子、炎症因子及趋化因子等是关键的影响因素。利用有效手段调节角膜基质细胞在不同表型之间的相互转化,或抑制角膜肌成纤维的增殖,是防治角膜瘢痕形成的关键[6]。多西环素为基质金属蛋白酶(MMP)的广谱抑制剂,可抑制MMP的活性及MMP和L-1[7]的合成。近年来,多西环素在抑制角膜细胞迁移、增殖及抗角膜新生血管形成中的作用越来越多地受到人们的关注。为此,我们通过研究多西环素对体外培养的牛角膜肌成纤维细胞增殖及相关蛋白表达的影响,为临床上探索安全有效的抑制角膜瘢痕的药物提供理论依据。 第一章牛角膜肌成纤维细胞的分离培养 目的：分离培养牛角膜肌成纤维细胞,为下一步实验提供所需的细胞模型。 方法：分别用基础培养液配制的1.0mg/ml及2.0mg/ml Ⅰ型胶原酶对牛角膜基质层进行二步消化分离,制成细胞悬液后转入培养瓶中用RPMI-1640培养液(含10%胎牛血清)培养。采用台盼蓝染色(TrypanBlue)检测消化分离后细胞存活率；倒置相差显微镜动态观察细胞的生长状态；取生长良好的细胞进行波形蛋白(Vimentin)免疫细胞化学染色以确定所培养的细胞来自角膜基质层。在细胞传代培养的同时,进行a-SMA (alpha-smooth muscle actin,a-平滑肌肌动蛋白)免疫荧光细胞化学染色,呈阳性表现的细胞为角膜肌成纤维细胞。四甲基偶氮唑盐比色法(MTT法)检测细胞增殖情况；取处于对数期的细胞,绘制细胞生长曲线并计算细胞群倍增时间。结果：在体外成功分离培养牛角膜肌成纤维细胞,显微镜下观察及免疫组织化学染色后证实所培养的细胞为角膜肌成纤维细胞。台盼蓝染色,细胞即刻成活率达93.5%。细胞生长曲线近似“S”形,其群体倍增时间为38.70h。 结论：此细胞培养技术简便、经济、高效,为原代培养角膜肌成纤维细胞提供了有效渠道。 第二章多西环素对体外培养的牛角膜肌成纤维细胞增殖的影响 目的：研究多西环素(Doxycycline, DOX)对体外培养的牛角膜肌成纤维细胞增殖的影响,并探讨其作用机制。 方法：1.选用生长良好的牛角膜肌成纤维细胞进行实验分组：根据实验设计分三大实验组：阴性对照组(无药物干预),阳性对照组(地塞米松120mg/L)及各浓度梯度(10mg/L、20mmg/L、40mmg/L、60mg/L及80mg/L)多西环素药物干预组。2.指标测定：采用MTT法、流式细胞仪细胞周期分析技术测定各实验组在对角膜肌成纤维细胞干预24h和48h后,对细胞的增殖、细胞周期时相分布的影响。 结果：1.MTT法显示：在DOX的干预下,活性角膜肌成纤维细胞的数量均有不同程度的下降,并呈浓度及时间依赖性,差异有统计学意义(P0.05)。同一时间段,当药物浓度达60mg/L时与阳性对照组两两比较,作用效果高于阳性对照组,差异有统计学意义(P0.05)。2.流式细胞仪细胞周期分析显示：DOX可改变角膜肌成纤维细胞在周期各时相的分布,对GO-G1期有显著阻滞作用,并呈浓度及时间依赖性,差异有统计学意义(P0.05)。DOX浓度达60mg/L时作用效果与阳性对照组无明显差异(P0.05)。 结论：在10～80mg/L浓度范围内,DOX对体外培养的牛角膜肌成纤维细胞的增殖具有明显的抑制作用,呈剂量-时间-效应依赖性。在药物浓度达到60mg/L时与120mg/L DXM拥有相当的作用效果。 第三章多西环素对体外培养的牛角膜肌成纤维细胞AgNORs增生及a-SMA表达的抑制作用 目的：通过研究多西环素(Doxycycline, DOX)对角膜肌成纤维细胞相关蛋白合成及表达的影响,旨在从细胞分子水平探索抑制角膜瘢痕发生发展的机制。 方法：1.选用生长良好的牛角膜肌成纤维细胞进行实验分组：根据实验设计分三大实验组：阴性对照组(无药物干预),阳性对照组(地塞米松120mg/L)及各浓度梯度(10mg/L、20mg/L、40mg/L、60mg/L及80mg/L)多西环素药物干预组。2.指标测定：采用核仁组成区嗜银蛋白染色(AgNORs)及a-SMA免疫荧光细胞化学染色等技术测定各实验组在对角膜肌成纤维细胞干预24h和48h后,对细胞DNA复制及a-SMA合成的影响。 结果：1.AgNORs染色显示：DOX药物浓度组AgNORs合成较阴性对照组明显减少,并呈浓度及时间依赖性,当药物浓度达60mg/L时作用效果与阳性对照组无明显差异(P0.05)。2.a-SMA免疫荧光细胞化学染色后通过病理图像分析仪测定,行荧光定量分析：DXM药物干预组对a-SMA的合成无明显作用(P0.05)；DOX药物干预组可抑制角膜肌成纤维细胞中a-SMA的合成,且呈浓度及时间依赖性,差异有统计学意义(P0.05)。 结论：在10～80mg/L浓度范围内,DOX可抑制体外培养的牛角膜肌成纤维细胞的AgNORs增生,呈剂量-时间-效应依赖性；在药物浓度达到60mg/L时与120mg/L DXM拥有相当的作用效果。DOX同时具有抑制细胞合成a-SMA的作用,与DXM比较,对抑制角膜瘢痕的形成更具研究价值。
[Abstract]:The cornea ' s unique anatomy makes it act as the first refractive medium of the eye , completes more than 90 % of the refractive power , and can cause visual impairment once the cornea is formed . Therefore , the cornea transparency is an important guarantee for the normal vision .

Berryhill , B . L . , Wilson , S . E . , Netto , M . V . et al . have shown that the phenotypic transformation of corneal stromal cells into myofibroblasts is the main mechanism of corneal scarring . As a broad - spectrum inhibitor of matrix metalloproteinase ( MMP ) , the role of polycytolysin in inhibiting corneal cell migration , proliferation and corneal neovascularization has been paid more and more attention in recent years .

Chapter 1 Isolation and culture of bovine corneal muscle fibroblasts

Objective : To isolate and culture bovine corneal muscle fibroblasts and provide the required cell model for the next step .

Methods : The bovine corneal stroma was digested with 1.0 mg / ml and 2.0 mg / ml collagenase type 鈪，

本文编号：1959274