虹膜在角膜移植免疫排斥反应中的病理、功能变化及其机制研究

发布时间：2018-06-20 00:54

本文选题：角膜移植免疫排斥 + 虹膜　；参考：《青岛大学》2017年博士论文

【摘要】：目的:研究角膜移植免疫排斥反应中虹膜的病理及功能改变,在此基础上探讨前房植入环孢素A缓释片(Cyclosporine A drug delivery system,Cs A DDS)防治角膜移植免疫排斥反应的可能机制。方法:(1)角膜移植免疫排斥时虹膜的病理改变建立以BALB/C小鼠为角膜供体及受体的同系移植组,以C57BL/6J小鼠为角膜供体、BALB/C小鼠为角膜受体的异系移植组,在此基础上着重对虹膜的病理变化进行分析。于术后2周异系移植组小鼠发生角膜移植免疫排斥反应时进行以下实验:(1)血管通透性变化检测:分别采用异硫氰酸荧光素葡聚糖(FITC-Dextran)及伊文思蓝(Evans Blue)为染料行血管造影观察各组小鼠虹膜血管通透性的变化,并通过房水涂片瑞氏-吉姆萨染色观察房水中免疫细胞的浸润情况;(2)细胞因子检测:通过实时荧光定量PCR(quantitative real-time PCR,q RT-PCR)比较各组小鼠虹膜内主要细胞因子白细胞介素1β(Interleukin-1β,IL-1β)、IL-6、IL-12等表达水平的差异;(3)免疫细胞分析:应用免疫荧光染色观察各组小鼠虹膜内CD4+T淋巴细胞的浸润情况;(4)NF-κB活性分析:利用免疫荧光技术检测虹膜内NF-κB活性的变化(主要检测p65、磷酸化p65的表达和细胞内定位)。(2)免疫微环境改变对虹膜色素上皮细胞功能的影响及其可能机制利用小鼠虹膜色素上皮细胞(Iris pigment epithelial cells,IPEs)与脾淋巴细胞共培养模型,研究IFN-γ模拟的炎性免疫微环境对IPE细胞功能的影响。将IPE细胞分为正常对照组、IFN-γ组、IFN-γ+Cs A组、IFN-γ+NF-κB抑制剂(JSH23)组,分别刺激48小时,收集各组IPE细胞与羟基荧光素二醋酸盐琥珀酰亚胺脂(5,6-carboxyfluorescein diacetate succinimidyl ester,CFSE)标记的脾淋巴细胞共培养96h,进行以下分析:(1)通过流式细胞技术检测各组IPE细胞对CD4+T细胞增殖的抑制率;(2)采用ELISA检测各组共培养上清中IFN-γ和IL-2的含量;(3)应用Western blot技术分析IPE细胞中NF-κB活性的变化。(3)前房植入Cs A DDS对虹膜的影响及其抑制角膜移植免疫排斥反应的可能机制利用缝线法诱导兔角膜新生血管并在新生血管化的植床上行穿透性角膜移植,将实验动物随机分为对照组及Cs A DDS组,其中对照组术后未予药物干预,Cs ADDS组在行角膜移植术时前房植入Cs A DDS。术后观察角膜植片的变化情况并着重分析虹膜的病理改变,行如下实验:(1)临床观察:利用裂隙灯显微镜评估角膜植片的排斥情况并绘制角膜生存曲线,通过激光共聚焦显微镜(in vivo laser scanning confocal microscopy)和眼前节光学相干断层成像(anterior segment optical coherence tomography,AS-OCT)等检查评估前房植入Cs A DDS防治角膜移植免疫排斥反应的效果;(2)虹膜及房水病理改变:借助虹膜苏木素-伊红染色、房水涂片瑞氏-吉姆萨染色观察前房植入Cs A DDS对虹膜及房水的影响;(3)虹膜中细胞因子检测:应用q RT-PCR比较各组虹膜中细胞因子和共刺激分子的表达水平差异;(4)房水中细胞因子测定:采用ELISA技术检测房水中IL-2的含量;(5)虹膜中免疫细胞分析:利用免疫荧光技术比较各组虹膜中CD4+T淋巴细胞的浸润情况;(6)虹膜内NF-κB活性分析:通过免疫荧光技术比较各组虹膜中NF-κB的活性变化(主要检测p65的表达和细胞内定位)。结果:(1)角膜移植免疫排斥时虹膜内的炎症反应增强与同系移植组相比,异系移植组小鼠虹膜内血管管腔明显扩大,血管的渗漏性显著增强;虹膜和角膜中IL-1β、IL-6、IL-12、IL-15的m RNA表达水平显著上调、并出现大量CD4+T淋巴细胞的浸润;虹膜和角膜中p65及磷酸化p65的表达水平均明显增强,且主要定位于细胞核,提示角膜移植免疫排斥过程中虹膜及角膜中的NF-κB处于活化状态。(2)NF-κB活性增强导致IPE细胞免疫抑制功能下降在IFN-γ模拟的炎性免疫微环境下,IPE细胞抑制CD4+T细胞增殖的能力明显降低,其共培养上清中IL-2及IFN-γ的含量显著增加;而Cs A可显著增强IPE细胞对CD4+T细胞增殖的抑制作用(P0.01),并有效减少共培养上清中IL-2及IFN-γ的含量(P0.01)。此外,在IFN-γ刺激下IPE细胞的NF-κB活性显著增强(主要表现为p65的磷酸化水平明显增加),而Cs A则可明显抑制IPE细胞的NF-κB活性(主要表现为p65磷酸化水平显著下降);同时利用小分子化合物JSH23抑制NF-κB也能增强IPE细胞的免疫抑制功能,提示Cs A可通过抑制NF-κB的活性改善IPE细胞的免疫抑制功能。(3)前房植入Cs A DDS可有效减轻虹膜内的炎症反应与对照组相比,前房植入Cs A DDS除可以显著抑制角膜内的免疫反应外,还可以显著改善虹膜及房水的病理变化:前房植入Cs A DDS可明显抑制虹膜内的血管扩张并减少房水中免疫细胞的浸润,降低虹膜中IFN-γ、IL-2、IL-6及共刺激分子CD80、CD86的表达水平,抑制房水内IL-2的表达水平(P0.01),减少虹膜内CD4+T淋巴细胞的浸润。此外,Cs A DDS组虹膜中p65的表达水平及其细胞核定位也较对照组明显减少,提示Cs A DDS对上述病理变化的改善作用可能与NF-κB活性降低有关。结论:(1)角膜移植免疫排斥过程中,虹膜内炎症反应增强,NF-κB异常活化。(2)在IFN-γ模拟的炎性免疫微环境下,IPE细胞NF-κB的活性增强导致其免疫抑制功能下降,而Cs A可通过抑制NF-κB的活性显著改善IPE细胞的免疫抑制功能。(3)前房植入Cs A DDS除抑制角膜内的免疫反应外,还可通过抑制虹膜内的炎症反应有效防治角膜移植免疫排斥。
[Abstract]:Objective : To study the pathological and functional changes of iris in mice with corneal transplantation , and to investigate the possible mechanism of transplantation immune rejection in mice . Methods : ( 1 ) The changes of the expression of IL - 1尾 , IL - 1尾 , IL - 6 , IL - 12 in the iris were observed by means of real - time PCR and quantitative real - time PCR . ( 2 ) The effect of immune microenvironment on the function of iris pigment epithelial cells and its possible mechanism were used to study the effect of inflammatory immune microenvironment on IPE cell function by using mouse iris pigment epithelial cells ( IPEs ) . Objective : To investigate the effect of anterior chamber implantation of Cs A DDS on iris and corneal allograft rejection . ( 2 ) To investigate the effect of corneal transplantation on iris and aqueous humor in anterior chamber . In addition , the activity of NF - 魏B in the anterior chamber significantly inhibited the expression level of IL - 2 and IFN - 纬 in the iris , and the expression level of IL - 2 and IFN - 纬 in the iris was significantly decreased . ( 3 ) In addition to inhibiting the immune response in the cornea , the anterior chamber can effectively prevent corneal transplantation immune rejection by inhibiting the inflammatory response in the iris .
【学位授予单位】：青岛大学
【学位级别】：博士
【学位授予年份】：2017
【分类号】：R779.65

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