泛素结合酶UBE2T在鼻咽癌发生发展中的作用及其机制探讨

发布时间：2018-07-14 10:37

【摘要】：研究背景及目的鼻咽癌(Nasopharyngeal carcinoma, NPC)是临床上常见的恶性肿瘤之一,全球年发病率约为25/100,000,在世界范围内分布极不均匀,东南亚及我国南方沿海,如广东、广西、福建、香港等地高发,且发病率在上述地区呈逐年增长的趋势,严重威胁着我国人民的生命健康。大多数鼻咽癌为非角化型未分化癌,以高度增殖及转移潜能为特征,对放射线较为敏感,放射治疗是其首选的治疗手段。对于早期鼻咽癌患者,随着早诊及精确放射治疗技术的应用,5年生存率虽高达67%-80%,但仍有部分患者会发生局部复发和或远处转移；而对于初治就存在远处转移鼻咽癌患者,愈后更差。因此阐明鼻咽癌发生、发展机制,探寻促进鼻咽癌增殖及转移的相关因素,将有利于发现鼻咽癌诊断及预后分子标记和靶标、指导临床个体化治疗,进一步改善鼻咽癌患者的预后。鼻咽癌的发生、发展被认为与EB病毒感染、人种及地域等因素密切相关。近年研究表明：多种癌基因与抑癌功能基因的突变或异常表达促进鼻咽癌的恶性表型,在鼻咽癌的发生、发展中扮演着重要的角色,因而成为研究的热点。泛素蛋白酶系统在多种细胞生命活动中扮演着重要的角色,其主要由三种不同类型的酶及蛋白酶体组成,正常情况下,泛素活化酶E1在ATP存在的条件下促进泛素分子同泛素结合酶E2作用,在E3连接酶的作用下,介导泛素分子单泛素化或多泛素化相应的蛋白底物分子,导致相应底物分子的降解,或功能改变,而编码上述酶系统的功能基因自身的异常或表达异常被认为同多种恶性肿瘤的发生及发展密切相关。泛素结合酶E2T (ubiquitin-conjugating enzyme E2T, UBE2T),属于泛素结合酶E2家族成员,其具有一个大小约16～18 kDa特征性的保守结构域----泛素结合(UBC)结构域。其最先被认识是在范可尼贫血(Fanconi anemia)的相关研究中,UBE2T可作为范可尼信号通路(FA pathway)重要成员参与DNA损伤修复,正常情况下DNA的损伤首先激活范可尼通路,随后泛素激活酶(E1酶)将泛素分子传递给泛素结合酶E2即UBE2T;接着UBE2T将泛素分子传递给该通路中的由8个主要成员组成的核心复合体(FANCA、FANCB、 FANCC、FANCE、FANCF、FANCG、FANCL及FANCM);核心复合体再将泛素分子传递给FANCD2,导致FANCD2单泛素化,单泛素化的FANCD2向细胞核DNA损伤点聚集,促进DNA损伤分子的修复,进而维持基因组的完整性。而这一FA通路中的任一成员,包括UBE2T功能的失调均可能导致基因组稳定性下降,诱发范可尼贫血或肿瘤易感倾向。Chantal H.M.A. Ramaekers的研究证实：在乏氧条件下,下调UBE2T的表达可增加化疗药物DNA损伤,增加化疗敏感性,这进一步说明UBE2T在维持基因组完整性方面的重要作用。除维持基因组完整性方面的作用外,新近的研究表明UBE2T在肺癌、前列腺癌、乳腺癌中的表达明显高于相应的癌旁组织,且UBE2T高表达水平同部分上述恶性肿瘤患者肿瘤大小、转移等恶性特征及不良预后密切相关,这提示UBE2T可能具有促进恶性肿瘤增殖、侵袭及转移的潜能。进一步的研究显示UBE2T促进NIH3T3细胞株克隆形成；且UBE2T可介导BRCA1特异性的泛素化降解,促进乳腺癌细胞的增殖；Wen等的研究则阐明过表达UBE2T可通过作用于Vemintin,介导前列腺癌癌细胞的增殖、EMT及转移。上研究均说明UBE2T在多种恶性肿瘤的发生、发展中起着重要的作用,但UBE2T与鼻咽癌患者临床特征间的相关性,及对鼻咽癌细胞增殖、侵袭和转移能力的影响尚未见报道。本研究试图探讨UBE2T与鼻咽癌患者恶性特征及预后间的相关性,及其对鼻咽癌细胞增殖、侵袭及转移的影响和可能的分子机制,为将UBE2T作为鼻咽癌的分子诊断、预后判断标记及分子靶向治疗靶标提供理论依据。本研究拟采用免疫组化技术(IHC)检测UBE2T在149例鼻咽癌样本中的表达,分析UBE2T表达同鼻咽癌患者恶性特征及不良预后间的相关性,并进一步通过表达和(或)干扰UBE2T基因表达、western blot及免疫荧光(immunoflurescence, IF)等技术探讨UBE2T对鼻咽癌细胞体内外增殖及转移的影响和可能的机制。方法1、UBE2T在鼻咽癌患者组织样本中的表达利用免疫组织化学技术(Immunohistochemical staining, IHC)检测149例鼻咽癌患者石蜡组织样本中UBE2T的表达水平,并进行IRS (immunoreactive score, IRS)评分,明确UBE2T在鼻咽癌及相应癌旁组织中的表达水平；根据评分高低,采用Spearman相关分析评价UBE2T表达与鼻咽癌各临床特征参数之间的相关性；并应用Kaplan-Meier生存分析和Log-rank检验探讨UBE2T表达水平对鼻咽癌患者预后的影响；运用单因素及多因素COX比例风险回归模型评价各临床特征参数及UBE2T表达水平对鼻咽癌患者预后的影响(单因素分析有意义者(P0.05)被纳入多因素分析),明确UBE2T是否是鼻咽预后判断的独立风险因子。2、探讨UBE2T体内外促鼻咽癌细胞增殖及转移效应2.1 UBE2T体内、外促鼻咽癌增殖作用通过western blot检测UBE2T在多株鼻咽癌细胞株中的表达,筛选出UBE2T相对低表达株C666-1及相对高表达株CNE2,进行相应的过表达及干扰试验。用过表达慢病毒载体Lv-UBE2T或小干扰RNA siUBE2T转染鼻咽癌细胞株,构建UBE2T过表达C666-1细胞株或UBE2T沉默的CNE2细胞株,采用western blot方法检测转染后UBE2T在各鼻咽癌细胞株中的表达水平,然后利用MTT法检测慢病毒UBE2T过表达对鼻咽癌细胞株C666-1,及CCK8法检测UBE2T siRNA干扰对鼻咽癌细胞株CNE2体外增殖的影响。通过平板克隆试验检测慢病毒UBE2T过表达对C666-1鼻咽癌细胞株体外克隆形成能力的影响。为检测UBE2T过表达对鼻咽癌细胞体外增殖的影响,共转染荧光素酶慢病毒及LV-UBE2T慢病毒构建荧光追踪的UBE2T过表达C666-1鼻咽癌细胞株；为检测UBE2T干扰对鼻咽癌细胞株CNE2体内增殖的影响,UBE2T干扰慢病毒载体LV-sh UBE2T转染构建UBE2T沉默的CNE2鼻咽癌细胞株。分别于BALB/c裸鼠双侧背部皮下注射UBE2T过表达及对照C666-1鼻咽癌细胞株,和UBE2T干扰及对照CNE2鼻咽癌细胞株构建裸鼠皮下瘤模型,采用活体成像技术、瘤体称重和Ki-67免疫组化染色等技术检测UBE2T过表达对C666-1鼻咽癌细胞株和UBE2T干扰对CNE2鼻咽癌细胞株体外增殖能力的影响。2.2 UBE2T体、内外促鼻咽癌细胞迁移、侵袭及转移作用在建立LV-UBE2T过表达或siUBE2T干扰的鼻咽癌细胞株的基础上,通过划痕试验检测UBE2T过表达对鼻咽癌细胞株C666-1体外迁移能力的影响,以及UBE2T干扰对鼻咽癌细胞株CNE2体外迁移能力的影响；通过基质胶Transwell检测UBE2T过表达对C666-1鼻咽癌细胞株以及UBE2T干扰对CNE2鼻咽癌细胞株体外侵袭能力的影响。将LV-UBE2T及荧光素酶慢病毒共转染的C666-1鼻咽癌细胞株BALB/c裸鼠鼠尾静脉注射,通过活体成像、HE染色技术检测UBE2T过表达对鼻咽癌细胞株C666-1体内转移能力的影响。3、UBE2T促进鼻咽癌细胞株增殖、侵袭及转移的机制利用western blot技术检测UBE2T慢病毒过表达对C666-1及siRNA干扰对CNE2鼻咽癌细胞株促增殖及转移相关蛋白标记(Cyclin D1、C-JUN、C-MYC、 MMP2、MMP9)和AKT/GSK3β/β-catenin信号通路蛋白(p-AKT、P-GSK3β、 β-catenin)表达的影响；利用免疫荧光技术和核浆蛋白分离western blot技术检测UBE2T对C666-1鼻咽癌细胞株β-catenin核浆转位的影响。通过普通Transwell及基质胶ranswell检测AKT特异性抑制剂(MK-2206 2HCl)对UBE2T促迁移、侵袭的阻断作用；western blot技术检测MK-2206 2HCl对UBE2T活化AKT/GSK3β/β-catenin信号通路效应的阻断作用,及其对增殖、转移相关标记蛋白表达的影响；并通过连续切片免疫组化技术检侧UBE2T、β-GSK3β在鼻咽癌样本中的表达并分析其相关性。结果1、UBE2T的表达水平同鼻咽癌患者恶性特征及预后密切相关149例鼻咽癌患者石蜡切片免疫组化的结果显示：UBE2T不同程度的表达于鼻咽癌细胞的细胞浆中,而在癌旁正常细胞中无或仅轻度表达于正常鼻咽粘膜的基底部(其中肿瘤组织中阳性表达为140/149,癌旁正常组织中位10/90,P0.001)。在典型的鼻咽癌癌巢中,癌巢周围肿瘤细胞UBE2T的表达水平明显高于癌巢中央。Spearman相关性分析则表明UBE2T的表达水平同鼻咽癌患者的T分期(P=0.006),M分期(P=0.038),及颅底侵犯(P=0.022)密切相关,Kaplan-Meier生存分析及log-rank检验的结果表明UBE2T高表达鼻咽癌患者预后明显差于低表达者(P=0.006)；单因素及多因素COX风险回归分析表明：UBE2T表达水平(P=0.030)、N分期(P0.001)、M分期(P0.001)、颅底侵犯(P=0.043)是鼻咽癌患者预后不良的独立危险因素。2、UBE2T促进鼻咽癌细胞株的体内外增殖及转移2.1 UBE2T促进鼻咽癌细胞株体内外增殖western blot检测示UBE2T在鼻咽癌细胞株C666-1中相对低表达,在鼻咽癌细胞株CNE2中相对高表达,因而在后续试验中选择C666-1细胞株行过表达试验,选择CNE2细胞株行干扰试验。MTT及克隆形成试验示：慢病毒载体UBE2T过表达促进C666-1鼻咽癌细胞株体外增殖(P0.001)及克隆形成(P0.001)。CCK8检测示：siRNA干扰UBE2T抑制CNE2鼻咽癌细胞株体外增殖(P0.001)。慢病毒UBE2T过表达及对照C666-1鼻咽癌细胞株双侧鼠背部种植后,活体成像系统监测荧光值示：UBE2T过表达鼻咽癌细胞株增殖速度明显快于对照(P0.001)；于种植后11天处死裸鼠,UBE2T过表达组皮下瘤大小明显大于对照,并明显重于对照(P=0.024),且400×视野下皮下瘤中细胞增殖相关抗原ki-67阳性表达细胞数明显多于对照(P0.001)。UBE2T干扰的CNE2鼻咽癌细胞株于种植后10天皮下瘤大小明显小于对照,重量亦明显轻于对照(P0.001)。2.2 UBE2T促进鼻咽癌细胞株体内外侵袭、转移能力划痕试验及基质胶Transwell检测显示：慢病毒UBE2T过表达促进C666-1鼻咽癌细胞株体外迁移及侵袭(P0.001),而siRNA干扰UBE2T抑制CNE2鼻咽癌细胞株体外迁移及侵袭(P0.001)。裸鼠体内转移研究则表明：UBE2T过表达促进荧光标记C666-1鼻咽癌细胞株体内转移(UBE2T过表达组log2总荧光吸收值对照组,P=0.034)；经连续切片HE染色验证的转移器官数在UBE2T过表达组明显多于对照组。3、UBE2T促进NPC细胞增殖、侵袭及转移通过AKT/GSK3β/β-catenin信号通路介导western blot、免疫荧光及核浆分离western blot检测示：UBE2T过表达增加C666-1鼻咽癌细胞株β-catenin表达及核转位,促进其增殖、转移相关靶蛋白(Cyclin D1、C-JUN、C-MYC、MMP2、 MMP9)和AKT/GSK3β/β-catenin信号通路上游蛋白p-AKT及p-GSK3p表达；而UBE2T干扰抑制β-catenin及其促增殖、转移相关靶蛋白,抑制p-AKT及p-GSK3β表达。AKT特异性抑制剂(MK-22062HCl)可阻断UBE2T过表达促C666-1迁移及侵袭效应(P0.001),同时MK-22062HCl抑制UBE2T对β-catenin及其促增殖、转移相关靶蛋白(Cyclin D1、C-JUN、 C-MYC、MMP2、MMP9)的上调作用,并且能阻断UBE2T对p-AKT及p-GSK3β上调。20例鼻咽癌样本连续切片免疫组化结果示：UBE2T及P-GSK3p存在共表达且二者明显相关(P=0.007)。结论1、鼻咽癌患者癌组织中UBE2T表达水平明显高于癌旁正常组织；且UBE2T高表达同患者恶性特征及不良预后相关,是鼻咽癌预后不良的独立危险因素,提示UBE2T可作为鼻咽癌诊和预后判断的分子标记。2、UBE2T促进鼻咽癌细胞株体内外增殖、侵袭及转移,提示UBE2T可作为鼻咽癌分子靶向治疗的靶标。3、UBE2T通过激活Akt/GSK3β/β-catenin信号通路促进鼻咽癌细胞增殖、侵袭及转移,阐明了UBE2T促鼻咽癌侵袭转移的可能机制,并进一步提示UBE2T可作为鼻咽癌治疗的分子靶标。
[Abstract]:......
【学位授予单位】：南方医科大学
【学位级别】：博士
【学位授予年份】：2016
【分类号】：R739.63

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